慢病毒包装系统、其所制得的慢病毒及经该慢病毒转导的细胞及其应用技术方案

本发明专利技术提供一种慢病毒包装系统、其所制得的慢病毒及经该慢病毒转导的细胞及其应用。慢病毒包装系统包含：转移质粒，其包含TAR嵌合5

【技术实现步骤摘要】
慢病毒包装系统、其所制得的慢病毒及经该慢病毒转导的细胞及其应用


[0001]本专利技术是关于一种慢病毒包装系统，尤指一种包含编码TAR RNA结合蛋白基因的核苷酸序列的质粒及包含TAR嵌合5
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LTR的核苷酸序列的质粒的慢病毒包装系统。

技术介绍

[0002]慢病毒(lentivirus)为一种反转录病毒，被广泛用于传递目标基因至难以转染(hard
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to
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transfect)的细胞，例如：初代T细胞。有别于其他的反转录病毒，慢病毒可被转导至分裂(dividing)及未分裂(non
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dividing)的细胞。且若与VSV
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G蛋白合并使用，则可感染不同来源的细胞。此外慢病毒的RNA基因体容量约为10Kb，因而可用于传递较大或较复杂的基因序列。由于慢病毒具有这些优点，而被广泛应用于临床治疗。
[0003]慢病毒的制备，通常是将含有目标基因的转移质粒及包含慢病毒包装所需的病毒基因的其他质粒共同转染至293T细胞。在质粒转染后，包含目标基因序列的慢病毒颗粒会被释放至培养基中。接着，收取培养基、并进一步浓缩、配制成待使用浓度储存于
‑
80℃。
[0004]慢病毒包装系统在过去数十年持续发展，最初的第一代慢病毒包装系统包含三个质粒，分别为转移质粒、包膜质粒、及包含必要的HIV
‑
1病毒基因(gag、pol、tat及rev)及一些附属基因(vif、vpu、vpr及nef)的质粒。其中病毒的gag基因编码有许多病毒壳体蛋白；pol基因编码有用于病毒包装及感染的反转录酶、嵌合酶(integrase)及蛋白酶。而由于前述的四个附属基因对于病毒包装或是感染目标细胞并不是必须的，因此第二代慢病毒包装系统即将前述的四个附属基因移除。在第一代及第二代的病毒包装系统中，转移质粒上包含目标基因的病毒基因体的转录是由作为启动子的5
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LTR(long terminal repeat)及TAT蛋白所驱动，其中，TAT蛋白是一种转录活化调控蛋白(trans
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activating regulatory protein)，其可结合到LTR中的TAR(trans
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activation response)序列。
[0005]而在第三代慢病毒包装系统，为了进一步增加慢病毒的安全性，尤其是为了避免慢病毒复制能力的发展，而将包围(flank)在目标基因两端的LTR进行修饰、并将rev基因移到第四个质粒上，进一步降低基因重组的机会。而经修饰的LTR不再具有启动子的活性，转移质粒上的病毒基因体序列的转录改由加在经修饰的5
’
LTR前的劳氏肉瘤病毒启动子(Rous sarcoma virus promoter，RSV promoter)或巨细胞病毒启动子(cytomegalovirus promoter，CMV promoter)所驱动。在此情况下，tat基因是没有用处的，所以在第三代慢病毒包装系统中被移除了，通过减少基因来增加慢病毒包装系统的感染效率。
[0006]然而，与第二代慢病毒包装系统相比，第三代慢病毒包装系统虽然提高了安全性，却牺牲了慢病毒的产量。因此亟需一种能提高制造病毒效率的慢病毒包装系统。

技术实现思路

[0007]为了克服现有技术的缺点，本专利技术的目的在于不损及安全的情况下增加慢病毒包装系统所生产的慢病毒产量。
[0008]为达上述专利技术目的，本专利技术提供一种慢病毒包装系统(packaging system)，其包含：转移(transfer)质粒，其包含TAR嵌合5
’
LTR(trans
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activation response element
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reserved chimeric 5
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long terminal repeat)的核苷酸序列；至少一包装(packaging)质粒，其包含编码TAR RNA结合蛋白(TAR RNA binding protein)基因的核苷酸序列、rev基因的核苷酸序列、gag基因的核苷酸序列及pol基因的核苷酸序列；及包膜(envelope)质粒。
[0009]本专利技术藉由于第三代慢病毒包装系统中加入包含编码TAR RNA结合蛋白基因的核苷酸序列的质粒，而能提升所生产的慢病毒的产量及病毒效价，特别是病毒的功能效价(functional titer)，且亦能提升所产出的慢病毒于转导时的基因传递效能。
[0010]较佳地，所述编码TAR RNA结合蛋白基因的核苷酸序列为tat基因的核苷酸序列。
[0011]较佳地，所述tat基因的核苷酸序列包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。其为所述编码TAR RNA结合蛋白基因的至少一部分，且因为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列不含内含子，与第二代慢病毒包装系统常用的tat基因的核苷酸序列不同，而能具有较小的质粒尺寸。
[0012]较佳地，所述TAR嵌合5
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LTR的核苷酸序列中的TAR的核苷酸序列包含如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
[0013]较佳地，所述TAR嵌合5
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LTR的核苷酸序列，其5
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LTR的U3被破坏，并改以CMV或RSV启动子驱动。以使病毒不足以复制下去，提高安全性，而此编码TAR嵌合5
’
LTR是与第三代慢病毒包装系统相同。在本专利技术的一实施态样中，是以RSV启动子驱动。
[0014]较佳地，所述至少一包装质粒的数量等于所述编码TAR RNA结合蛋白基因的核苷酸序列、rev基因的核苷酸序列、gag基因的核苷酸序列及pol基因的核苷酸序列的数量，例如：当所述编码TAR RNA结合蛋白基因的核苷酸序列、rev基因的核苷酸序列、gag基因的核苷酸序列及pol基因的核苷酸序列的数量为各一，共四个时，质粒的数量亦为四个，亦即所述至少一包装质粒为第一包装质粒、第二包装质粒、第三包装质粒及第四包装质粒，且所述第一包装质粒包含所述编码TAR RNA结合蛋白基因的核苷酸序列、所述第二包装质粒包含rev基因的核苷酸序列、所述第三包装质粒包含gag基因的核苷酸序列及所述的第四包装质粒包含pol基因的核苷酸序列。较佳地，所述各个包装质粒具有各一序列。
[0015]较佳地，所述至少一包装质粒为第一包装质粒及第二包装质粒，且所述第一包装质粒包含所述编码TAR RNA结合蛋白基因的核苷酸序列、rev基因的核苷酸序列、gag基因的核苷酸序列及pol基因的核苷酸序列中的一者，而所述第二包装质粒包含所述编码TAR RNA结合蛋白基因的核苷酸序列、rev基因的核苷酸序列、gag基因的核苷酸序列及pol基因的核苷酸序列的其余者。例如：第一包装质粒包含所述编码TAR RNA结合蛋白基因的核苷酸序列，而第二包装质粒包含所述rev基因的核苷酸序列、gag基因的核苷酸序列及po本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种慢病毒包装系统，其包含：转移(transfer)质粒，其包含TAR嵌合5
’
LTR(trans
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activation response element
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reserved chimeric 5
’
long terminal repeat)的核苷酸序列；至少一包装(packaging)质粒，其包含编码TAR RNA结合蛋白(TAR RNA binding protein)基因的核苷酸序列、rev基因的核苷酸序列、gag基因的核苷酸序列及pol基因的核苷酸序列；及包膜(envelope)质粒。2.如权利要求1所述的慢病毒包装系统，其中，所述至少一包装质粒为第一包装质粒及第二包装质粒，且所述第一包装质粒包含所述编码TAR RNA结合蛋白基因的核苷酸序列、rev基因的核苷酸序列、gag基因的核苷酸序列及pol基因的核苷酸序列中的二者，而所述第二包装质粒包含所述编码TAR RNA结合蛋白基因的核苷酸序列、rev基因的核苷酸序列、gag基因的核苷酸序列及pol基因的核苷酸序列的其余者。3.如权利要求1所述的慢病毒包装系统，其中，所述至少一包装质粒为第一包装质粒、第二包装质粒、第三包装质粒及第四包装质粒，且所述第一包装质粒包含所述编码TAR RNA结合蛋白基因的核苷酸序列、所述第二包装质粒包含rev基因的核苷酸序列、所述第三包装质粒包含gag基因的核苷酸序列、且所述第四包装质粒包含pol基因的核苷酸序列。4.如权利要求1所述的慢病毒包装系统，其中，所述至少一包装质粒为第一包装质粒、第二包装质粒及第三包装质粒，且所述第一包装质粒包含所述编码TAR RNA结合蛋白基因的核苷酸序列、rev基因的核苷酸序列、gag基因的核苷酸序列及pol基因的核苷酸序列中的二者，而所述第二包装质粒及所述第三包装质粒分别包含所述编码TAR RNA结合蛋白基因的核苷酸序列、rev基因的核苷酸序列、gag基因的核苷酸序列及pol基因的核苷酸序列的其余任一者。5.如权利要求4所述的慢病毒包装系统，其中，所述第一包装质粒包含所述gag基因的核苷酸序列及所述pol基因的核苷酸序列；所述第二包装质粒包含所述编码...

【专利技术属性】
技术研发人员：林韦齐，周思妤，杨曜诚，林建廷，林成龙，
申请(专利权)人：沛尔生技医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：