抗原结合域自动优化的嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建、筛选方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种抗原结合域自动优化的嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建、筛选方法及其应用，该方法通过在细胞中插入一段嵌合抗原受体序列，并通过顺式作用元件及反式作用因子在胞外抗原结合域不断诱导突变产生，建立一个可供后续筛选的抗体序列动态库；抗体序列动态库被受体2展示在细胞表面，形成嵌合受体库细胞文库；受体1能够识别靶标抗原上的标签，并与能够识别靶标抗原的受体2形成二聚体，从而启动筛选基因的表达，并同时启动抑制系统来维持抗原结合域的稳定。筛选嵌合抗原受体文库，将筛得的阳性细胞嵌合受体的抗原结合域进行扩增测序，即可得到抗原识别区的核酸序列。此方法可用于多种抗体制备，更为简便高效。更为简便高效。更为简便高效。

【技术实现步骤摘要】
抗原结合域自动优化的嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建、筛选方法及其应用


[0001]本专利技术涉及抗原结合域自动优化的嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建、筛选方法及其应 用，属于基因工程


技术介绍

[0002]目前抗体在科研领域，检测领域，诊断、医疗领域等都发挥着不可替代的作用，随着嵌 合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR
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T)及免疫检查点疗法如火如荼的发展，目前对抗体的制 备也有了更大的需求以及更高的要求。，例如，嵌合抗原受体(CAR)胞外抗原结合域的单链 抗体(scFv)制备。CAR的胞外抗原结合域也多采用骆驼科动物和鲨鱼产生的天然缺乏轻链 的单域抗体(sdAb)，其被称为仅重链抗体(HcAb)，HcAb每个臂中的抗原结合片段具有单 个重链可变域(VHH)，可在无需轻链的帮助下，对抗原具有高亲和力，VHH被称为最小的 功能性抗原结合片段，分子量为大约15Kd，在CAR受体中被广泛应用。另外在对人的治疗 过程中经常需要人源化的抗体。
[0003]目前scFv及VHH大多通过传统的抗体制备方法获取，其主要步骤包括：1.抗原及佐剂 配制；2.动物免疫；3.抗血清采取；4.B淋巴细胞分离；5.杂交瘤制备/抗体序列扩增及建 库；6.抗体筛选；7.抗体序列的获取；8.scFv及VHH序列的进一步制备。另外还需要将制 备的抗体进行人源化处理，涉及人源化小鼠的应用，或抗体之间的拼接，整个流程步骤繁琐， 耗时费力，且成本高昂。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种抗原结合域自动优化的嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建方 法。
[0005]本专利技术的第二个目的是提供由上述构建方法制备得到的嵌合抗原受体修饰细胞文库。
[0006]本专利技术的第三个目的是提供一种抗原结合域自动优化的嵌合抗原受体修饰细胞文库的筛 选方法。
[0007]本专利技术的第四个目的是提供上述筛选方法在制备抗体中的应用。
[0008]本专利技术的第五个目的是提供由上述方法筛选得到的抗体。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供了一种抗原结合域自动优化的嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建 方法，将包含第一基因元件、第二基因元件、第三基因元件、第四基因元件以及第五基因元 件的一个或多个载体转染至细胞内，即得到嵌合抗原受体修饰细胞文库；
[0011]所述第一基因元件为编码受体1的核苷酸序列，所述受体1包括胞外域，跨膜域及胞内 域；所述胞外域可识别靶标抗原上所标记的生物素或6
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His标签，所述胞内域包括烟草蚀纹 病毒蛋白酶TEVP；
[0012]所述第二基因元件为编码受体2的核苷酸序列，所述受体2包括胞外抗原结合域、跨膜 域以及胞内信号域；所述抗原结合域为抗体序列动态库，所述动态库是在第四基因元件的作 用下诱导产生一系列突变，引入序列多样性所得；所述胞内信号域包括tTA转录因子结构域 以及连接序列，所述连接序列连接tTA转录因子结构域和跨膜域，包含TEVP可识别切割的 序列；
[0013]所述第三基因元件为编码筛选基因的核苷酸序列，tTA转录因子可以启动所述筛选基因 的表达，使宿主产生荧光、获得某种抗性、或者获得在某种条件下的生长优势；
[0014]所述第四基因元件为编码一种或多种顺式调控元件和一种或多种反式作用因子的核苷酸 序列；所述顺式调控元件能够使DNA产生特殊结构的DNA序列，所述特殊结构是指DNA 结构中含有未发生碱基互补配对的DNA单链结构，所述的特殊结构包括R
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loop，G
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三联体 以及G
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四联体；所述反式作用因子为Cas蛋白家族及Cas蛋白家族的变体、gRNA、尿嘧啶 糖基化酶抑制剂、腺嘌呤脱氨酶、胞苷脱氨酶、RNA
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DNA杂合链结合蛋白、感光蛋白、 Nucleolin、DNA解旋酶、易错DNA聚合酶、重组酶、核酸内切酶、核酸外切酶、烷基腺嘌 呤糖基化酶中的一种或多种的组合；
[0015]所述第五基因元件为编码抑制系统的核苷酸序列，tTA转录因子可以启动所述抑制系统 的表达，进而敲减或敲除反式作用因子，使抗体序列动态库维持稳定；或所述第五基因元件 为编码光控制系统的核苷酸序列，所述光控制系统能够调控第四基因元件的表达：在光照条 件下启动第四基因元件的表达，开始构建抗体动态序列库；停止光照后，第四基因元件功能 被抑制，使抗体动态序列库维持稳定。
[0016]优选的，所述细胞是真核细胞或原核细胞，进一步优选的，所述细胞是人源或鼠源细胞， 更为优选的，所述细胞为293T。
[0017]优选的，所述抗体序列动态库包括传统抗体库、单链抗体库及纳米抗体库。
[0018]优选的，所述受体1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0019]优选的，所述受体2是由Notch受体改造而来的synNotch受体，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3所示。
[0020]优选的，所述反式作用因子包括以下Cas蛋白家族成员及其部分结构域：Cas3
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8s、Cas10s、 Cas11s、Cas9s、xCas9、Cas12s、Cas13s和Cas14s。
[0021]优选的，所述反式作用因子包括以下腺嘌呤脱氨酶及其部分结构域：ecTadA、mADA、 hADAR2和hADAT2。
[0022]优选的，所述反式作用因子包括以下胞苷脱氨酶及其部分结构域：AID(activation
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inducedcytidine deaminase)、APOBEC3G、APOBEC1和CDA1。
[0023]优选的，所述编码光控制系统的核苷酸序列包括以下感光蛋白及其部分结构域：BphS、 Cph1、PCB、PhyB
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PIFs、PΦB、BphP1
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PpsR2、BphP1
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Q
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PAS1、LOV2
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Jα、PhyB、PIF6、 Epdz和Photoreceptor Vivid(VVD)。
[0024]优选的，所述Cas蛋白家族是一类通过gRNA对基因组特定位点进行识别、导向的蛋白 家族。
[0025]优选的，所述光控制系统发挥对第四基因元件的调控作用需要光照的配合，所述光照包 括可见光、不可见光、蓝光、红光、远红外光及紫外光。
[0026]优选的，所述筛选基因包括GFP、mCherry、Luciferase、嘌呤霉素抗性基因、博来霉
素 和新霉素抗性基因。
[0027]优选的，所述抑制系统是通过tTA转录因子启动负调控蛋白，阻遏蛋白，siRNA， CAS9/gRNA表达或通过反向转录方式，敲减或敲除反式作用因子，使抗体序列动态库维持稳 定。
[0028]第二方面，本专利技术提供了由上述构建方法获得的抗原结合域自动优本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗原结合域自动优化的嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建方法，其特征在于，将包含第一基因元件、第二基因元件、第三基因元件、第四基因元件以及第五基因元件的载体转染至细胞内，所述载体为一个或多个，即得到嵌合抗原受体修饰细胞文库；所述第一基因元件为编码受体1的核苷酸序列，所述受体1包括胞外域，跨膜域及胞内域；所述胞外域可识别靶标抗原上所标记的生物素或6
×
His标签，所述胞内域包括烟草蚀纹病毒蛋白酶TEVP；所述第二基因元件为编码受体2的核苷酸序列，所述受体2包括胞外抗原结合域、跨膜域以及胞内信号域；所述抗原结合域为抗体序列动态库，所述动态库是在第四基因元件的作用下诱导产生一系列突变，引入序列多样性所得；所述胞内信号域包括tTA转录因子结构域以及连接序列，所述连接序列连接tTA转录因子结构域和跨膜域，包含TEVP可识别切割的序列；所述第三基因元件为编码筛选基因的核苷酸序列，tTA转录因子可以启动所述筛选基因的表达，使宿主产生荧光、获得某种抗性、或者获得在某种条件下的生长优势；所述第四基因元件为编码一种或多种顺式调控元件和一种或多种反式作用因子的核苷酸序列；所述顺式调控元件能够使DNA产生特殊结构的DNA序列，所述特殊结构是指DNA结构中含有未发生碱基互补配对的DNA单链结构，所述的特殊结构包括R
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loop，G
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三联体以及G
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四联体；所述反式作用因子为Cas蛋白家族及Cas蛋白家族的变体、gRNA、尿嘧啶糖基化酶抑制剂、腺嘌呤脱氨酶、胞苷脱氨酶、RNA
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DNA杂合链结合蛋白、感光蛋白、Nucleolin、DNA解旋酶、易错DNA聚合酶、重组酶、核酸内切酶、核酸外切酶、烷基腺嘌呤糖基化酶中的一种或多种的组合；所述第五基因元件为编码抑制系统的核苷酸序列，tTA转录因子可以启动所述抑制系统的表达，进而敲减或敲除反式作用因子，使抗体序列动态库维持稳定；或所述第五基因元件为编码光控制系统的核苷酸序列，所述光控制系统能够调控第四基因元件的表达：在光照条件下启动第四基因元件发挥作用，开始构建抗体动态序列库；停止光照后，第四基因元件功能被抑制，使抗体动态序列库维持稳定。2.根据权利要求1所述嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建方法，其特征在于，所述细胞为人源或鼠源细胞。3.根据权利要求1所述嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建方法，其特征在于，所述抗体序列动态库包括传统抗体库、单链抗体库及纳米抗体库。4.根据权利要求1所述嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建方法，其特征在于，所述受体1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。5.根据权利要求1所述嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建方法，其特征在于，所述受体2是由Notch受体改造而来的synNotch受体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。6.根据权利要求1所述嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建方法，其特征在于，所述反式作用因子包括以下Cas蛋白家族成员及其部分结构域：Cas3
‑
8s、Cas10s、Cas11s、Cas9s、xCas9、Cas12s、Cas13s和Cas14s。7.根据权利要求1所述嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建方法，其特征在于，所述反式作用因子包括以下腺嘌呤脱氨酶及其...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛志远，朱武凌，郭长江，支灵通，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：