高表达FRα的重组载体、重组细胞及其构建方法和用途技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体而言，本发明专利技术涉及一种包含FRα编码基因的重组病毒载体、包含FRα编码基因的重组病毒颗粒、高表达FRα的重组细胞及其构建方法和用途。本发明专利技术通过选择特定的表达FRα的基因序列，构建含有FRα编码基因的重组病毒载体及重组病毒颗粒，然后将其稳转到MDA

【技术实现步骤摘要】
高表达FR
α
的重组载体、重组细胞及其构建方法和用途


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种高表达FRα的重组载体、重组细胞及其构建方法和用途。

技术介绍

[0002]叶酸受体α(FRα)由FOLR1基因编码，是分子量为38
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40kDa的细胞表面糖蛋白，最初发现是作为叶酸结合蛋白，能在牛奶中和叶酸结合，1991年作为肿瘤相关抗原被克隆。FRα是高亲和力FRs家族的一个成员，FRs家族还包括FRβ、FRγ和FRδ，它们分别由FOLR2、FOLR3和FOLR4基因编码。
[0003]FRα对还原叶酸(如5
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甲基四氢叶酸和四氢叶酸)和叶酸有很高的亲和力，这些叶酸与FRα的结合促进了细胞膜上受体
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配体复合物的聚集，然后经过胞吞作用内化、与溶酶体融合并酸化，最终释放出叶酸，参与之后的碳转移反应。FRα现已被证实在正常细胞中表达受限，而在绝大多数的卵巢癌以及在很多子宫癌、子宫内膜癌、胰腺癌、肾癌、肺癌和乳腺癌中过度表达，FRα参与肿瘤的浸润、转移、进展，成为肿瘤治疗有吸引力的靶点。因此，目前FRα相关的靶向药物也在临床中有着广泛的应用，在临床诊断方面的应用有靶向FRα的叶酸基共轭放射性核素造影剂以及叶酸
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FITC偶联探针进行荧光成像等；在治疗方面的应用更是百花齐放，从目前在研的产品药物类型去看，FRα在CAR
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T、PROTAC、抗体、ADC、PDC药物等方面均有着应用。

技术实现思路

[0004]专利技术要解决的问题
[0005]目前，FRα缺乏体外高表达媒介。为此，本专利技术通过选择特定的表达FRα的FOLR1基因，构建含有FOLR1基因的报告系统载体，然后将其稳转到MDA
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MB
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231细胞株中，获得高表达FRα的抗肿瘤药物筛选细胞模型，可用于以FRα为靶点的抗肿瘤药物的靶向药效评价。
[0006]用于解决问题的方案
[0007][1]、一种包含叶酸受体α的编码基因的重组病毒载体，其中，
[0008]所述叶酸受体α的编码基因包含如下(i)或(ii)所示的核苷酸序列：
[0009](i)如SEQ ID NO.1所示的序列；
[0010](ii)与SEQ ID NO.1所示的序列具有80％以上同源性的核苷酸序列；
[0011]所述病毒载体选自腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体；
[0012]优选地，所述重组病毒载体为重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体包含如下(iii)或(iv)所示的核苷酸序列：
[0013](iii)如SEQ ID NO.2所示的序列；
[0014](iv)与SEQ ID NO.2所示的序列具有80％以上同源性的核苷酸序列。
[0015][2]、一种包含叶酸受体α的编码基因的重组病毒颗粒，其中，所述重组病毒颗粒由如[1]所述的重组病毒载体经过病毒包装后得到。
[0016][3]、一种表达叶酸受体α的重组细胞，其中，所述重组细胞包含如[2]所述的重组病毒颗粒；优选地，所述重组细胞来源于如下任一种细胞系：MDA
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MB
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231、HEC1B、PANC
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1、TK10、A549。
[0017][4]、一种表达叶酸受体α的重组细胞的构建方法，其中，所述构建方法包括如下步骤：
[0018]病毒感染步骤：将如[2]所述的重组病毒颗粒与癌细胞、细胞培养基和聚凝胺混合，进行共孵育；
[0019]筛选步骤：利用荧光筛选或抗生素筛选阳性克隆细胞。
[0020][5]、根据[4]所述的构建方法，其中，在所述病毒感染步骤中，所述病毒感染的MOI值为20～50。
[0021][6]、根据[4]或[5]所述的构建方法，其中，在所述病毒感染步骤中，所述癌细胞选自如下任一种细胞：MDA
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MB
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231、HEC1B、PANC
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1、TK10、A549。
[0022][7]、根据[4]～[6]中任一项所述的构建方法，其中，在所述病毒感染步骤中，所述聚凝胺的工作浓度为5～10μg/mL；所述细胞培养基为含有1％～7％(v/v)胎牛血清的IMDM培养基；
[0023]可选的，所述聚凝胺的工作浓度为5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL或10μg/mL；
[0024]可选的，所述细胞培养基中胎牛血清的含量为1％(v/v)、2％(v/v)、3％(v/v)、4％(v/v)、5％(v/v)、6％(v/v)或7％(v/v)。
[0025][8]、根据[4]～[7]中任一项所述的构建方法，其中，在所述筛选步骤中，所述抗生素为嘌呤霉素；
[0026]可选的，所述嘌呤霉素的工作浓度为1～20μg/mL；
[0027]可选的，所述嘌呤霉素的工作浓度为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、15μg/mL、16μg/mL、17μg/mL、18μg/mL、19μg/mL或20μg/mL。
[0028][9]、根据[3]所述的表达叶酸受体α的重组细胞，和/或根据权利要求[4]～[8]中任一项所述的方法构建的重组细胞在如下(a)～(c)至少一种中的用途：
[0029](a)靶向叶酸受体α的药物的筛选；
[0030](b)靶向叶酸受体α的药物的药效评价；
[0031](c)作为靶向叶酸受体α的药物筛选或药效评价的细胞模型；
[0032]优选地，所述靶向叶酸受体α的药物为抗肿瘤药物，更优选抗乳腺癌药物。
[0033][10]、一种靶向叶酸受体α的药物的筛选方法，其中，所述方法包括将所述靶向叶酸受体α的药物与根据[3]所述的表达叶酸受体α的重组细胞，和/或根据[4]～[8]中任一项所述的方法构建的重组细胞共孵育的步骤。
[0034]专利技术的效果
[0035]通过上述技术方案的实施，本专利技术取得了以下有益效果：
[0036]在一些实施方案中，本专利技术提供了一种新的含有FOLR1基因的重组病毒载体，可用于构建含有FOLR1基因的重组病毒，并可用于药物的研究、评价。
[0037]在一些具体的实施方案中，本专利技术提供了含有FOLR1基因的重组慢病毒载体，能够
用于高效、稳定表达FRα的细胞模型的构建，实现对乳腺癌药物的筛选、评价。
[0038]在一些实施方案中，本专利技术提供了一种新的含有FOLR1基因的重组病毒颗粒，可用于构建稳定表达FRα的重组细胞，并可用于FRα靶向药物的研发测试。
[0039]在一些具体的实施方案中，本专利技术提供了含有FOLR1基因的重组慢病毒颗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包含叶酸受体α的编码基因的重组病毒载体，其中，所述叶酸受体α的编码基因包含如下(i)或(ii)所示的核苷酸序列：(i)如SEQ ID NO.1所示的序列；(ii)与SEQ ID NO.1所示的序列具有80％以上同源性的核苷酸序列；所述病毒载体选自腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体；优选地，所述重组病毒载体为重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体包含如下(iii)或(iv)所示的核苷酸序列：(iii)如SEQ ID NO.2所示的序列；(iv)与SEQ ID NO.2所示的序列具有80％以上同源性的核苷酸序列。2.一种包含叶酸受体α的编码基因的重组病毒颗粒，其中，所述重组病毒颗粒由如权利要求1所述的重组病毒载体经过病毒包装后得到。3.一种表达叶酸受体α的重组细胞，其中，所述重组细胞包含如权利要求2所述的重组病毒颗粒；优选地，所述重组细胞来源于如下任一种细胞系：MDA
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MB
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231、HEC1B、PANC
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1、TK10、A549。4.一种表达叶酸受体α的重组细胞的构建方法，其中，所述构建方法包括如下步骤：病毒感染步骤：将如权利要求2所述的重组病毒颗粒与癌细胞、细胞培养基和聚凝胺混合，进行共孵育；筛选步骤：利用荧光筛选或抗生素筛选阳性克隆细胞。5.根据权利要求4所述的构建方法，其中，在所述病毒感染步骤中，所述病毒感染的MOI值为20～50。6.根据权利要求4或5所述的构建方法，其中，在所述病毒感染步骤中，所述癌细胞选自如下任一种细胞：MDA
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MB
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231、HEC1B、PANC
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1、TK10、A549。7....

【专利技术属性】
技术研发人员：卜婷婷，严柳柳，张楠，
申请(专利权)人：同宜医药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：