母源因子诱导的2C样全能干细胞及其转化应用制造技术

本发明专利技术公开了一种母源因子诱导的2C样全能干细胞及其转化应用，本发明专利技术解决了以下问题：1.用四个母源因子诱导产生2C样全能干细胞及相关方法；2.2C样全能干细胞体外分化为囊胚的方法；3.2C样全能干细胞体外分化为透明带壳囊胚的方法；4.一种包含四个母源因子的表达载体。本发明专利技术首次证明四个母源因子Hsf1、Zar1、Padi6和Npm2可重编程体细胞为2C样全能干细胞。这些方法和技术的建立与转化在临床医学与生物医学研究及哺乳动物物种保护研究领域具有巨大的应用潜能。有巨大的应用潜能。有巨大的应用潜能。

【技术实现步骤摘要】
母源因子诱导的2C样全能干细胞及其转化应用


[0001]本专利技术一般涉及生物技术与工程领域，尤其涉及一种母源因子诱导的2C样全能干细胞及其转化应用。

技术介绍

[0002]干细胞领域的三个里程碑式的进展，包括第一个里程碑小鼠胚胎干细胞系和胚胎生殖干细胞系的建立、第二个里程碑人胚胎干细胞系的建立和第三个里程碑小鼠诱导多潜能性干细胞系的建立(iPSC技术)。iPSC技术规避了卵细胞和胚胎的缺陷、免疫排斥反应及伦理的限制，实现了个体化特异的体细胞重编程，使个体化精准细胞替代治疗和再生医学成为可能。iPSC技术的建立将干细胞的研究与转化应用推入一个以全新概念发展的新领域。然而，经过二十多年的广泛研究，其机制的不可阐述性、可诱导体细胞不完全重编程导致肿瘤和生产效力低等缺陷，限制了该技术的潜在应用价值；有50多年研究历史的细胞核转移技术(SCNT技术)是目前公认的成功地诱导全能性干细胞产生的唯一方法。然而，不可克服的卵资源缺乏、异体免疫排斥和伦理上的争议是限制该技术应用的主要障碍。近期报道的联合化学小分子诱导多潜能扩展干细胞技术(EPSC技术)无疑将诱导干细胞技术向临床应用推进了一步，但存在小分子特异性不强，靶点不单一和分子机制不清楚或不可阐述性等问题。因此，揭示重编程全能干细胞的细胞因子及其分子机制仍然是国际上公认的具有战略意义的重大而尚未解决的科学问题之一。
[0003]小鼠卵母细胞在发育生长过程中积累大量母源因子(Maternal
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effect factor，MF)，对卵及卵泡的发育没有影响，但在早期胚胎发育过程中发挥关键作用。受精后，母源因子以100％效率，将两个终分化的配子卵细胞和精子转化为一个具有全能分化能力的合子，标志着全能干细胞干性的获得，这是一个完全依赖母源因子的过程。随之，合子经历第一次细胞有丝分裂为2
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细胞胚胎，获得全能干细胞特性并伴随胚胎基因组激活。在卵细胞
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合子转变及发育到2
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细胞胚胎期的时间窗内(即早期胚胎细胞获得全能干性的时间窗内)发挥极其关键的调控作用，因此母源因子很可能与早期胚胎细胞重新获得全能干性和转化为全能性干细胞密切相关。迄今为止，对于母源因子的分子作用机制及其在重编程体细胞获得全能干性和诱导全能性干细胞产生的研究仍处于起步阶段。国际上尚无母源因子诱导全能性干细胞的报道。
[0004]理论上，候选母源因子诱导体细胞重编程的分子机制具有可阐述性。其所具有的优势将有助于拓展诱导干细胞生物学技术的潜在应用前景，包括：(1)候选母源因子诱导的全能样干细胞系可以用作实验工具进一步研究诱导重编程体细胞为全能干细胞和受精后早期胚胎细胞自然重编程获得全能干性的分子机制以及随后细胞命运决定的分子机制；(2)候选母源因子诱导的全能样干细胞近似从早期胚胎获得的全能干细胞，具有更大的细胞可塑性，更可控而有效地进行后续分化为均一的组织特异的多能和/或单能干细胞。是实现临床个性化细胞替代治疗的理想细胞；(3)揭示候选母源因子的生物学功能及其分子作用机制也将为生殖医学领域中改进试管受精成功的新方法、研发新的避孕措施以及制定新
的拯救濒危动物物种新方案提供新的理论基础和实践指导；(4)有助推动和促进一系列新的以卵细胞生物学为基础的干细胞生物学技术和生殖医学技术的研发和应用。

技术实现思路

[0005]针对上述技术中存在的不足之处，本专利技术提供了母源因子诱导的2C样全能干细胞及其转化应用，首次证明所述四个母源因子可重编程体细胞为2C样全能干细胞。在此基础上，提供了2C样全能干细胞体外囊胚分化技术和透明带壳囊胚技术。这些方法和技术的建立与转化在临床医学与生物医学研究及哺乳动物物种保护研究领域具有巨大的应用潜能。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供一种母源因子顺式表达盒，所述母源因子顺式表达盒从5
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到3
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依次包含以下元件：
[0007](1)强启动子；
[0008](2)由具有自我剪接功能的2A多肽碱基序列连接的四个母源因子cDNA序列组合；
[0009](3)终止密码子；
[0010]所述母源因子为小鼠(mus musculus)来源，四个母源因子为Heat shock factor 1(Hsf1)，NCBI数据库参考序列:NM_008296.2；Zygote arrest 1(Zar1)，NCBI数据库参考序列:NM_174877.3；Peptidyl arginine deiminase,type VI(Padi6)，NCBI数据库参考序列:NM_153106.2和Nucleophosmin/nucleoplasmin 2(Npm2)，NCBI数据库参考序列:NM_181345.3；所述Hsf1的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示；所述Zar1的cDNA序列如SEQ ID NO：2所示；所述Padi6的cDNA序列如SEQ ID NO：3所示；所述Npm2的cDNA序列如SEQ ID NO：4所示；所述强启动子为EF1α。
[0011]本专利技术的一个实施例中，所述母源因子顺式表达盒由以下方式构建：
[0012](1)合成从NCBI数据库获得的每个母源因子的cDNA序列；
[0013](2)去掉前三个母源因子cDNA的终止密码子，保留最后一个母源因子的cDNA的终止密码子，分别用具有自我剪切功能的2A多肽基因碱基序列P2A、T2A、E2A将所述去除终止密码子的母源因子cDNA序列依次连接，形成由一个强启动子调控的四个母源因子cDNA序列组合的读码框，即所述四个母源因子cDNA序列组合；此时，所述母源因子顺式表达盒的终止密码子为最后一个母源因子cDNA的终止密码子。
[0014]作为优选，所述母源因子顺式表达盒还包含表达标签蛋白mGFP的cDNA序列或表达标签多肽C
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Myc
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DDK的DNA序列，设置于所述四个母源因子cDNA序列组合和所述终止密码子之间。
[0015]在本专利技术的另一个实施例中，所述母源因子顺式表达盒由以下方式构建：
[0016](1)合成从NCBI数据库获得的每个母源因子的cDNA序列以及标签蛋白mGFP的cDNA序列或标签多肽C
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Myc
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DDK的cDNA序列；
[0017](2)去掉每个母源因子cDNA的终止密码子；
[0018](3)分别用具有自我剪切功能的2A多肽基因碱基序列P2A、T2A、E2A将所述去除终止密码子的母源因子cDNA序列依次连接，形成所述四个母源因子cDNA序列组合，第四个母源因子cDNA与标签蛋白mGFP的cDNA序列或标签多肽C
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Myc
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DDK的cDNA序列相连，终止密码子添加在由一个强启动子调节的开放cDNA读码框的末端。
[0019]作为优选，所述P2A的碱基序列为：
[0020]GCCACGAACTTCTCTC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种母源因子顺式表达盒，其特征在于，所述母源因子顺式表达盒从5
’
到3
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依次包含以下元件：(1)强启动子；(2)由具有自我剪接功能的2A多肽碱基序列连接的四个母源因子cDNA序列组合；(3)终止密码子；所述四个母源因子为Hsf1、Zar1、Padi6和Npm2；所述Hsf1的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示；所述Zar1的cDNA序列如SEQ ID NO：2所示；所述Padi6的cDNA序列如SEQ ID NO：3所示；所述Npm2的cDNA序列如SEQ ID NO：4所示；所述强启动子为EF1α。2.根据权利要求1所述的母源因子顺式表达盒，其特征在于，还包含表达标签蛋白mGFP的cDNA序列或表达标签多肽C
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Myc
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DDK的cDNA序列，设置于所述四个母源因子cDNA序列组合和所述终止密码子之间。3.根据权利要求1或2所述的母源因子顺式表达盒，其特征在于，所述2A多肽碱基序列为P2A、T2A和E2A，所述P2A的碱基序列为：GCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCT；所述T2A的碱基序列为：GAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCA；所述E2A的碱基序列为：CAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAACCCAGGTCCC。4.一种母源因子顺式表达载体，其特征在于，所述母源因子顺式表达载体含有权利要求3所述的母源因子表达盒，并且表达四个母源因子或表达四个母源因子加标签蛋白mGFP或标签多肽C
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DDK；表达载体为慢病毒载体pLenti
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IRES
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Puro。5.一种2C样全能干细胞，其特征在于，所述2C样全能干细胞含有权利要求4所述的母源因子顺式表达载体，并且表达四个母源因子或四个母源因子加所述标签蛋白mGFP或标签多肽C
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Myc
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DDK。6.一种利用权利要求4所述母源因子顺式表达载体重编程体细胞获得2C样全能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1:构建权利要求4所述的母源因子顺式表达载体；S2:制备包含所述四个母源因子的慢病毒或包含所述四个母源因子加标签蛋白mGFP或标签多肽C
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Myc
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DDK的慢病毒；S3：构建2C报告细胞；S4：利用包含所述四个母源因子的慢病毒或包含所述四个母源因子加标签蛋白mGFP或标签多肽C
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DDK的慢病毒感染所述2C报告细胞，获得2C样全能干细胞。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，将编码水疱性口炎病毒糖蛋白G的质粒，编码呼吸道合胞病毒rev的质粒，包含囊膜核基质表达基因Gag的质粒，包含表达蛋白酶、反...

【专利技术属性】
技术研发人员：桂黎明，吴瑞芳，
申请(专利权)人：北京大学深圳医院，
类型：发明
国别省市：