一种CAR-T治疗载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种CAR

【技术实现步骤摘要】
immunotherapy[J].Oncogene,2014,33(47):5405
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5414)可分别抑制三阴性乳腺癌和胰腺癌的生长与转移。YW327.6S2可抑制肿瘤的生长、转移、血管生成，抑制肿瘤相关巨噬细胞分泌炎症因子，合用可增强VEGF抑制剂，EGFR抑制剂以及化疗的疗效(X Ye,Li Y,Stawicki S,et al.An anti
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Axl monoclonal antibody attenuates xenograft tumor growth and enhances the effect of multiple anticancer therapies[J].Oncogene,2010,29(38):5254
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5264)。MAb173可诱导降解AXL，在体内抑制卡波西肉瘤的生长(Ren Liu,Gong Ming,Li Xiuqing,et al.Induction,regulation,and biologic function of Axl receptor tyrosine kinase in Kaposi sarcoma[J].Blood,2010,116(2):297
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305)。AXL抗体偶联药物AXL
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107
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MMAE的安全性在食蟹猴身上获得验证，没有出现AXL
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特异性毒性(Julia Boshuizen,Koopman Louise
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A,Krijgsman Oscar,et al.Cooperative targeting of melanoma heterogeneity with an AXL antibody
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drug conjugate and BRAF/MEK inhibitors[J].Nature Medicine,2018,24(2):203
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212)。2018年的一项研究使用人源CD8+T细胞构建了AXL特异性CAR
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T细胞，并发现其对表达AXL的肿瘤细胞具有杀伤作用且分泌出高水平的IFN
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γ和IL
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2(Jang
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Hwan Cho,Okuma Atsushi,Al
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Rubaye Dalal,et al.Engineering Axl specific CAR and SynNotch receptor for cancer therapy[J].Scientific Reports,2018,8(1))。综上所述，针对AXL的肿瘤免疫治疗具有极大的研究前景。

技术实现思路

[0005]为了发挥CAR
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T细胞对肿瘤的特异性杀伤作用，获得高滴度的重组慢病毒载体，本专利技术公开了一种CAR
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T治疗载体，包括AXL scFv；所述AXL scFv包括依次连接的AXL单链抗体轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；linker接头，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；AXL单链抗体重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0006]进一步地，所述AXL单链抗体轻链可变区的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:3的核苷酸序列；所述linker接头的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列；所述AXL单链抗重轻链可变区的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
[0007]进一步地，还包括人EF1α启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；CD8 hinge区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；CD28，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；CD3ζ，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
[0008]所述人EF1α启动子、所述信号肽、所述AXL scFv、所述CD8 hinge区、所述CD28和所述CD3ζ依次连接；所述信号肽位于所述AXL单链抗体轻链可变区的N端；所述linker接头位于所述AXL单链抗体轻链可变区的C端。
[0009]进一步地，包括：
[0010]pSPAX2质粒，用于表达慢病毒外壳；
[0011]pMD2G质粒，用于表达慢病毒的膜蛋白；
[0012]携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒，用于转录AXL嵌合分子的RNA；依次连接的所述人EF1α启动子、所述信号肽、所述AXL scFv、所述CD8 hinge区、所述CD28和所述CD3ζ均位于所
述携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒中；
[0013]其中，所述信号肽的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列；所述CD8 hinge区的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列；所述CD28的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:7的核苷酸序列；所述CD3ζ的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
[0014]进一步地，所述AXL单链抗体重链可变区与所述CD8 hinge区之间通过由甘氨酸残基和丝氨酸残基组成的二肽连接；所述二肽的核苷酸序列包括5
’‑
GGATCC
‑3’
或其他编码所述二肽的核苷酸序列；所述人EF1α启动子与所述信号肽之间通过如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列连接。
[0015]本专利技术还公开了一种如上所述的CAR
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T治疗载体的构建方法，包括以下步骤：
[0016]步骤一、将AXL scFv插入穿梭质粒的多克隆位点，得到携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒；
[0017]步骤二、将所述步骤一得到的携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒与pSPAX2质粒、pMD2G质粒共同转染HEK293T细胞，在HEK293T细胞中进行基因转录、逆转录、表达后，使包装成功的重组慢病毒载体释放到细胞培养液中，收集包含重组慢病毒载体的上清液；
[0018]步骤三、将所述步骤二得到的重组慢病毒载体的上清液通过抽滤、吸附、洗脱纯化得到重组慢病毒载体。
[0019]进一步地，所述步骤一具体为：
[0020]将如SEQ ID NO:1所示的人EF1α启动子的核苷酸序列、如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO:9所示的信号肽的核苷酸序列、如SEQ ID NO:10所示的AXL单链抗体轻链可变区的核苷酸序列、如SEQ ID NO:11所示的linker接头的核苷酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CAR
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T治疗载体，其特征在于，包括AXL scFv；所述AXL scFv包括依次连接的AXL单链抗体轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；linker接头，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；AXL单链抗体重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。2.如权利要求1所述的CAR
‑
T治疗载体，其特征在于，所述AXL单链抗体轻链可变区的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:3的核苷酸序列；所述linker接头的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列；所述AXL单链抗重轻链可变区的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:5的核苷酸序列。3.如权利要求1所述的CAR
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T治疗载体，其特征在于，还包括人EF1α启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；CD8 hinge区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；CD28，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；CD3ζ，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述人EF1α启动子、所述信号肽、所述AXL scFv、所述CD8 hinge区、所述CD28和所述CD3ζ依次连接；所述信号肽位于所述AXL单链抗体轻链可变区的N端；所述linker接头位于所述AXL单链抗体轻链可变区的C端。4.如权利要求3所述的CAR
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T治疗载体，其特征在于，包括：pSPAX2质粒，用于表达慢病毒外壳；pMD2G质粒，用于表达慢病毒的膜蛋白；携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒，用于转录AXL嵌合分子的RNA；依次连接的所述人EF1α启动子、所述信号肽、所述AXL scFv、所述CD8 hinge区、所述CD28和所述CD3ζ均位于所述携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒中；其中，所述信号肽的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列；所述CD8 hinge区的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列；所述CD28的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:7的核苷酸序列；所述CD3ζ的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列。5.如权利要求3所述的CAR
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T治疗载体，其特征在于，所述AXL单链抗体重链可变区与所述CD8 hinge区之间通过由甘氨酸残基和丝氨酸残基组成的二肽连接；所述二肽的核苷酸序列包括5
’‑
GGATCC
‑3’
或其他编码所述二肽的核苷酸序列；所述人EF1α启动子与所述信号肽之间通过如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列连接。6.一种如权利要求1所述的CAR
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T治疗载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、将AXL scFv插入穿梭质粒的多克隆位点，得到携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒；步骤二、将所述步骤一得到的携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒与pSPAX2质粒、pMD2G质粒共同转染HEK293T细胞，在HEK293T细胞中进行基因转录、逆转录、表达后，使包装成功的重组慢病毒载体释放到细胞培养液中，收集包含重组慢病毒载体的上清液；步骤三、将所述步骤二得到的重组慢病毒载体的上清液通过抽滤、吸附、洗脱纯化得到重组慢病毒载体。7.如权利要求6所述的CAR
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T治疗载体的构建方法，其特征在于，所述步骤一具体为：
将如SEQ ID NO:1所示的人EF1α启动子的核苷酸序列、如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO:9所示的信号肽的核苷酸序列、如SEQ ID NO:10所示的AXL单链抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱棣，余科，吴重恩，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：