一种α-珠蛋白过表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种α

【技术实现步骤摘要】
一种
α
‑
珠蛋白过表达载体及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种α
‑
珠蛋白过表达载体及其应用。

技术介绍

[0002]正常血红蛋白是由两条α
‑
珠蛋白链和两条β
‑
珠蛋白链组成的四聚体。有两个功能性α
‑
血红蛋白基因，分别命名为HBA1和HBA2。α地中海贫血病(α地贫)是由于α珠蛋白基因缺失或功能障碍使α
‑
珠蛋白链的合成减少或不能合成，造成α链和非α链合成不均衡所引起的一种常染色体隐性遗传病。α
‑
珠蛋白基因簇上常见的缺失有αα/
‑‑
SEA
和
‑
α
4.2
/
‑
α
4.2
等，其发生机理是由于α珠蛋白基因一条或两条染色体发生同源性和非同源性重组而缺失，该基因缺失可使α珠蛋白基因表达水平下调而降低α珠蛋白链产生。
[0003]据报道，α地中海贫血是世界上最常见的单基因遗传病之一，在地中海、东南亚、非洲、中东和印度次大陆尤其常见，在我国长江以南地区发病率较高。根据世界卫生组织(WHO)估计，全球20％的人口可能有一个或多个α
‑
珠蛋白基因缺失。中国南方省份及东南亚地区，最常见的缺失类型为
‑‑
SEA(东南亚缺失型)、
‑
α
4.2
(左缺失)和
‑
α
3.7
(右缺失)三种。在过去几十年中，由于人口结构的变化，北欧和北美的α地中海贫血发病率有所上升。目前，国内外对地中海贫血有效的治疗手段包括异源性造血细胞移植、规范性长期输血和去铁治疗，但是有排斥风险，并发症和其它毒性效应，因此基因治疗方案正在被评估作为一种新的方案。
[0004]近年来，由于基因工程技术的突飞猛进，CRISPR/Cas技术俨然已经成为科学界的热点之一。研究表明，CRISPR/Cas系统相较于其他基因编辑工具，在干细胞中有更高的切割效率，可用于构建疾病模型、筛选药物，制备治疗性干细胞等，为疾病治疗带来了新希望，但可能存在的脱靶风险不容忽视。病毒载体具有高感染率、低细胞毒性的特点，目前仍然是很多科学研究和临床试验的较优方案。慢病毒载体衍生自HIV
‑
1慢病毒，包含多个用于增加转导效率的辅助元件、病毒包装和/或增加治疗基因表达的元件，以及经过修饰的5'LTR和/或3'LTR，这样的载体整合入目的细胞后，即使存在所有病毒蛋白也不能转录出RNA，使病毒变成复制缺陷型来增加慢病毒系统的安全性。慢病毒载体具有能感染非分裂期细胞、容纳外源性目的基因片段大、稳定性强、感染效率高等特点。
[0005]第三代慢病毒系统，将gag、pol基因与rev或env基因分别构建在不同的质粒上，并且在病毒基因组的3'LTR引入缺失以产生自失活(SIN)慢病毒载体，破坏LTR的启动子/增强子活性，进一步提高了安全性，并降低致癌风险。目前有2/3的基因治疗临床试验是运用病毒载体来引入基因到靶细胞目前使用较多的是来源于HIV的慢病毒载体。通过慢病毒载体进行基因治疗为血红蛋白病带来了新的选择，其临床研究已经开展，结果令人鼓舞，但远期疗效和安全性仍待证明。体外基因治疗，通过载体转移和染色体整合的基因添加一个正常的珠蛋白基因连同合适的顺式连接的调节元件到造血干细胞(HSCs)仍然是选择的方法。慢病毒载体基因治疗需要非常高效的造血干细胞感染效率和长期稳定的α
‑
珠蛋白表达才具有临床意义。
[0006]但目前现有技术中对珠蛋白过表达载体的研究几乎针对β
‑
珠蛋白基因，因此急需一种表达率适于临床应用的α
‑
珠蛋白过表达载体。

技术实现思路

[0007]本专利技术要解决的技术问题是为克服现有技术中缺乏表达α
‑
珠蛋白基因的过表达载体的缺陷，提供一种表达率适中的α
‑
珠蛋白过表达载体及其应用。
[0008]在人体中，α
‑
类珠蛋白基因的调控序列包含多种顺式和反式作用因子的结合位点，它们间的协同作用保证了α类珠蛋白基因表达的组织和时序特异性。而对于异源的α
‑
珠蛋白基因的表达调控，完全复制天然的过程需大量合成多种功能区序列，过程十分复杂且从成本上讲也难以实现；而对于目前已经取得一定研究进展的异源HBB基因的表达，均是基于天然HBB基因本身的调控元件进行表达调控，而对于异源α
‑
珠蛋白基因的表达调控元件的选择，现有技术却没有这方面的研究，因此，异源α
‑
珠蛋白基因的表达目前仍为一个技术难题。
[0009]为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案之一为：一种α
‑
珠蛋白过表达载体，其依次包含：(1)基因座控制区、α
‑
珠蛋白启动子、HBA2基因和HBA2基因3
’
sequence片段，所述基因座控制区为HS40；
[0010]或(2)基因座控制区HS4、HS3和HS2、β
‑
珠蛋白启动子、HBA2基因和HBB基因3
’
sequence片段。
[0011]所述依次包含指的是从5
’
端到3
’
端的依次包含。
[0012]较佳地，所述的α
‑
珠蛋白过表达载体依次包含顺式作用元件、HBA2基因和HBA2基因3
’
sequence片段，所述顺式作用元件由基因座控制区HS40和α
‑
珠蛋白启动子构成。
[0013]本专利技术所述α
‑
珠蛋白启动子较佳地为HBA2启动子；更佳地，其序列包含如SEQ ID NO:2所示的序列，或包含与如SEQ ID NO:2所示序列具有80％以上序列同一性的序列，例如，其序列如SEQ ID NO:2所示。
[0014]本专利技术所述基因座控制区HS40可为本领域常规，其序列优选包含如SEQ ID NO:1所示的序列，或包含与如SEQ ID NO:1所示序列具有80％以上序列同一性的序列，例如，其序列如SEQ ID NO:1所示。
[0015]本专利技术所述HBA2基因3
’
sequence片段可为本领域常规，其序列优选包含如SEQ ID NO:4所示的序列，或包含与如SEQ ID NO:4所示序列具有80％以上序列同一性的序列，例如，其序列如SEQ ID NO:4所示。
[0016]本专利技术中所述β
‑
珠蛋白启动子较佳地为HBB启动子；更佳地，其序列包含如SEQ ID NO:8所示的序列，或包含与如SEQ ID NO:8所示序列具有80％以上序列同一性的序列，例如，其序列如SEQ ID NO:8所示。
[0017]在本专利技术所述基因座控制区HS4可为本领域常本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种α
‑
珠蛋白过表达载体，其特征在于，其依次包含：(1)基因座控制区、α
‑
珠蛋白启动子、HBA2基因和HBA2基因3
’
sequence片段，所述基因座控制区为HS40；或(2)基因座控制区HS4、HS3和HS2、β
‑
珠蛋白启动子、HBA2基因和HBB基因3
’
sequence片段。2.如权利要求1所述的α
‑
珠蛋白过表达载体，其特征在于，其依次包含顺式作用元件、HBA2基因和HBA2基因3
’
sequence片段，所述顺式作用元件由基因座控制区HS40和α
‑
珠蛋白启动子构成。3.如权利要求1或2所述的α
‑
珠蛋白过表达载体，其特征在于，所述α
‑
珠蛋白启动子为HBA2启动子；较佳地，所述α
‑
珠蛋白启动子包含如SEQ ID NO:2所示的序列；和/或，所述基因座控制区HS40包含如SEQ ID NO:1所示的序列；和/或，所述HBA2基因3
’
sequence片段包含如SEQ ID NO:4所示的序列。4.如权利要求1所述的α
‑
珠蛋白过表达载体，其特征在于，所述β
‑
珠蛋白启动子为HBB启动子；较佳地，所述β
‑
珠蛋白启动子包含如SEQ ID NO:8所示的序列；和/或，所述基因座控制区HS4包含如SEQ ID NO:5所示的序列，所述基因座控制区HS3包含如SEQ ID NO:6所示的序列，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴宇轩，程艳，徐赛娟，赵飞燕，席在喜，刘明耀，
申请(专利权)人：上海邦耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：