【技术实现步骤摘要】
本专利技术是关于一种生产人类嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor tcell，car-t)的方法，尤其是一种生产富含干细胞样中央记忆表型t细胞的car-t细胞的方法。
技术介绍
1、car-t细胞疗法是利用基因编辑技术使t细胞表现能辨识肿瘤细胞表面抗原的受体；当改造的t细胞输回人体之后，能够辨识肿瘤细胞进而毒杀之。
2、然此疗法亦具有副作用，其中最严重的不良反应为细胞激素释放症候群(cytokine release syndrome，crs)，即当car-t细胞对抗肿瘤细胞时会大量释放细胞激素，产生过于激烈的发炎反应、微血管渗漏、凝血连锁反应，更甚者可能导致心脏、肺脏及肾脏衰竭或脑肿胀而危及生命。目前普遍认为，car-t细胞中若富含干细胞样中央记忆表型的t细胞(stem central memory t cell，tscm)，可以增加car-t细胞在人体内存续的时间，增加治疗疗效，并降低细胞激素释放症候群与神经学毒性的发生率及严重度。
3、然而，人体周边血液中tscm细胞比例仅约为1-5％。现有生产car-t细胞的技术中难以有效增加tscm细胞比例与数量，除了所得的tscm细胞比例不高，导致进行car-t细胞疗法可能造成严重细胞激素释放症候群与神经毒性之外，car-t进入人体后持续时间不够久也降低治疗疗效，且目前技术要产生足够量的car-t细胞以供输回人体对抗肿瘤细胞，一般会需要在体外扩增9至14天的时间，耗时甚久。
技术实现思路>
1、为了克服现有技术的缺点，本专利技术的目的为提供一种制备方法，可以在短时间内生产足够量的car-t细胞，且生产出的car-t细胞中富含干细胞样中央记忆表型t细胞(tscm)。
2、为达上述的专利技术目的，本专利技术提供一种生产富含tscm的人类嵌合抗原受体t细胞的方法，其包含：步骤(1)提供人类周边血液单核细胞(peripheral blood mononuclearcells；pbmc)；步骤(2)将磁珠加入所述人类pbmc，进行磁性分离，移除人类pbmc中的b细胞、nk细胞及单核球，得到人类t细胞与磁珠复合物，其中，所述磁珠的表面设有抗cd3的抗体及抗cd28的抗体；步骤(3)将所述人类t细胞与磁珠复合物培养16小时至20小时，进行t细胞活化，得到活化的人类t细胞与磁珠复合物；步骤(4)将慢病毒加入所述活化的人类t细胞与磁珠复合物，进行慢病毒转染40小时至48小时，得到人类car-t细胞与磁珠复合物；步骤(5)自所述人类car-t细胞与磁珠复合物移除所述磁珠，得到人类car-t细胞；及步骤(6)将所述人类car-t细胞培养92小时至96小时，得到富含tscm的人类car-t细胞。
3、本专利技术借由控制人类t细胞与磁珠接触的时间长短，经由7天培养所产出的人类car-t细胞有最佳的t细胞扩增量、并富含tscm，提供一种相较于现有技术具有更佳免疫功效的人类car-t细胞，而更适合用于car-t免疫疗法。
4、依据本专利技术，步骤(1)中的人类pbmc系来自人类的全血或经由白血球分离法采集的白血球成品(leukapheresis product)。且所述人类pbmc包含t细胞、b细胞、nk细胞及单核球。
5、依据本专利技术，所述人类为健康人类或患有癌症的病患。
6、依据本专利技术，所述磁珠可活化人类t细胞。较佳的，所述磁珠为dynabeadstmhumant-expander cd3/cd28(gibco，cat.no.11141d)或ctstm(cell therapy systems)dynabeadstm cd3/cd28(gibco,cat.no.40203d)。
7、较佳的，步骤(2)所述磁珠的数量为所述人类pbmc中人类t细胞数量的2至4倍，更佳的，所述磁珠的数量为所述人类pbmc中人类t细胞数量的3倍。
8、较佳的，步骤(3)及(4)的完全x-vivo 15培养基总体积与培养角瓶底面积比例为0.12至0.3。更佳的，步骤(3)及(4)的完全x-vivo 15培养基总体积与培养角瓶底面积比例为0.2至0.27。举例来说，当培养角瓶底面积为75平方公分(cm2)时，完全x-vivo 15培养基总体基可为9毫升(ml)至22.5ml。较佳的，当培养角瓶底面积为75cm2时，完全x-vivo 15培养基总体基可为15ml至20.25ml。
9、更佳的，若同时进一步控制步骤(2)所述磁珠的数量为所述人类pbmc中人类t细胞数量的2至4倍及步骤(3)、(4)的完全x-vivo 15培养基总体积与培养角瓶底面积比例为0.12至0.3，也就是同时控制人类t细胞与磁珠接触的时间长短、步骤(2)中磁珠与人类pbmc中人类t细胞数量比及步骤(3)、(4)的完全x-vivo 15培养基总体积与培养角瓶底面积比例，更可带来在短时间内大量扩增t细胞，且使得产出的人类car-t细胞富含tscm的效果。
10、较佳的，步骤(3)中人类t细胞与磁珠复合物是培养于36.5℃至37.5℃下16小时至20小时，例如可为16至19或17至19小时。更佳的，步骤(3)中人类t细胞与磁珠复合物是培养于37℃、5％二氧化碳的加湿环境下18小时。
11、较佳的，步骤(4)是在36.5℃至37.5℃下进行慢病毒转染40小时至56小时。更佳的，步骤(4)是在37℃、5％二氧化碳的加湿环境下进行慢病毒转染48小时。
12、较佳的，步骤(6)是将所述人类嵌合抗原受体t细胞培养于36.5℃至37.5℃下92小时至96小时。更佳的，步骤(6)是将所述人类嵌合抗原受体t细胞培养于37℃、5％二氧化碳的加湿环境下96小时。
13、较佳的，步骤(3)的人类t细胞与磁珠复合物培养、步骤(4)的慢病毒转染及步骤(6)的人类car-t细胞培养，是使用含有il-2的完全x-vivotm 15(lonza,cat.no.04-418q)培养基，且所述完全x-vivotm 15培养基中的il-2的浓度为200iu/ml。
14、依据本专利技术，完全x-vivotm 15培养基即为内含有200iu/ml的重组人类il-2(r&dsystems，cat no.202-il-500)的x-vivotm 15培养基。
15、较佳的，步骤(4)的慢病毒转染是将抗cd19、抗cd22、抗b细胞成熟抗原(b cellmaturation antigen，bcma)或抗间皮素的受体的基因转染至人类t细胞中。
16、较佳的，步骤(6)所得到的富含tscm的人类car-t细胞的数量为步骤(2)中的人类t细胞与磁珠复合物中的人类t细胞的数量的10倍以上，亦即经过步骤(6)扩增培养后所得到的扩增的人类car-t细胞的数量为步骤(2)中的人类t细胞与磁珠复合物中的人类t细胞的数量的10倍以上。更佳的，步骤(6)所得到的富含tscm的人类car-t细胞的数量为步骤(2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，包含：
2.如权利要求1所述的生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，所述人类周边血液单核细胞是分离自人类的全血。
3.如权利要求1所述的生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，步骤(2)中所述磁珠的数量为所述人类周边血液单核细胞中人类T细胞数量的2至4倍。
4.如权利要求1所述的生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的人类T细胞与磁珠复合物培养于36.5℃至37.5℃下16小时至20小时。
5.如权利要求1所述的生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，步骤(4)是在36.5℃至37.5℃下进行慢病毒转染40小时至48小时。
6.如权利要求1所述的生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，步骤(4)的慢病毒转染是将抗CD19、抗CD2
7.如权利要求1所述的生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，步骤(6)是将所述人类嵌合抗原受体T细胞，培养于36.5℃至37.5℃下90小时至96小时。
8.如权利要求1所述的生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，步骤(3)的人类T细胞与磁珠复合物培养、步骤(4)的慢病毒转染及步骤及(6)的将人类嵌合抗原受体T细胞进行培养，是使用完全X-VIVOTM 15培养基。
9.如权利要求1至8任一项所述的生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，步骤(6)得到的所述富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的数量为步骤(2)中所述人类T细胞与磁珠复合物中的人类T细胞的数量的10倍以上。
10.如权利要求1至8任一项所述的生产富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞的方法，其特征在于，步骤(6)得到的所述富含干细胞样中央记忆表型T细胞的人类嵌合抗原受体T细胞中，干细胞样中央记忆表型T细胞所占比例大于55％。
...【技术特征摘要】
1.一种生产富含干细胞样中央记忆表型t细胞的人类嵌合抗原受体t细胞的方法，其特征在于，包含：
2.如权利要求1所述的生产富含干细胞样中央记忆表型t细胞的人类嵌合抗原受体t细胞的方法，其特征在于，所述人类周边血液单核细胞是分离自人类的全血。
3.如权利要求1所述的生产富含干细胞样中央记忆表型t细胞的人类嵌合抗原受体t细胞的方法，其特征在于，步骤(2)中所述磁珠的数量为所述人类周边血液单核细胞中人类t细胞数量的2至4倍。
4.如权利要求1所述的生产富含干细胞样中央记忆表型t细胞的人类嵌合抗原受体t细胞的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的人类t细胞与磁珠复合物培养于36.5℃至37.5℃下16小时至20小时。
5.如权利要求1所述的生产富含干细胞样中央记忆表型t细胞的人类嵌合抗原受体t细胞的方法，其特征在于，步骤(4)是在36.5℃至37.5℃下进行慢病毒转染40小时至48小时。
6.如权利要求1所述的生产富含干细胞样中央记忆表型t细胞的人类嵌合抗原受体t细胞的方法，其特征在于，步骤(4)的慢病毒转染是将抗cd19、抗cd22、抗b细胞成熟抗原或抗间皮素的受体基因转染至所...
【专利技术属性】
技术研发人员：林建廷，林成龙，赖怡卉，林宣慧，董姿巡，
申请(专利权)人：沛尔生技医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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