一种真核细胞持续进化的控制方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，公开了一种真核细胞持续进化的控制方法及其应用，该方法包括以下步骤：(1)稳转细胞系构建；(2)持续多轮进化；(3)筛选突变体；(4)功能验证：在若干细胞内源性基因组位点验证，比较筛选后的突变体相对野生型的编辑情况，以没有转染的细胞为阴性对照，比较编辑效率，编辑窗口。本发明专利技术提供的方法、突变体及其应用，表达编辑效率和准确性更高、脱靶率更低的碱基编辑的细胞生存率更高，再经过持续的多轮进化，表达编辑效率和准确性较高、脱靶率较低的碱基编辑器的细胞会被筛选出来，具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学，具体涉及一种真核细胞持续进化的控制方法、所得突变体及其应用。

技术介绍

1、目前，优化基因编辑系统或碱基编辑器主要通过蛋白质工程(proteinengineering)和进化的方法实现的。蛋白质工程基于目标蛋白质的结构和功能，人工对其进行有目的的设计和改造，从而优化目标蛋白质的分子特性。蛋白质工程方法多次被用于改造碱基编辑系统。david r.liu团队通过蛋白质工程方法改造了cbe的胞苷脱氨酶，使得其编辑窗口缩小，但是发现编辑效率也有一定程度的降低。通过蛋白质工程技术分别突变cbe和abe的胞苷脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶可以降低它们的rna脱靶效应，但同时也观察到对一些dna位点编辑效率的下降。蛋白质工程技术由于只是修改了局部的氨基酸位点，其无法完全避免其他区域或整体结构和功能的改变。因此，通过蛋白质工程技术改造过的碱基编辑器可能仍有很大的提升潜力。

2、进化的方法优化碱基编辑系统，可以分为原核进化和真核进化。原核进化系统具有进化周期短的优点(大肠杆菌约20分钟繁殖一代，而哺乳动物细胞大约24小时增殖一代)，原核进化平台也较本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种真核细胞持续进化的控制方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的真核细胞持续进化的控制方法，其特征在于，步骤二中的引入突变处理包括以下步骤：

3.如权利要求2所述的真核细胞持续进化的控制方法，其特征在于，所述的dCas9表达质粒包括混有低比例的、宽编辑窗口的A到G,C到T,C到G的编辑器。

4.如权利要求1所述的真核细胞持续进化的控制方法，其特征在于，步骤二中的引入瞬时转染的筛选质粒包括如下步骤：

5.如权利要求1所述的真核细胞持续进化的控制方法，其特征在于，步骤二中的抗生素筛选突变体处理包括如下步骤：

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【技术特征摘要】

1.一种真核细胞持续进化的控制方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的真核细胞持续进化的控制方法，其特征在于，步骤二中的引入突变处理包括以下步骤：

3.如权利要求2所述的真核细胞持续进化的控制方法，其特征在于，所述的dcas9表达质粒包括混有低比例的、宽编辑窗口的a到g,c到t,c到g的编辑器。

4.如权利要求1所述的真核细胞持续进化的控制方法，其特征在于，步骤二中的引入瞬时转染的筛选质粒包括如下步骤：

5.如权利要求1所述的真核细胞持续进化的控制方法，其特征在于，步骤二中的抗生素筛选突变体处理包括如下步骤：

6.如权利要求5所述的真核细胞持续进化的控制方法，其特征在于，细胞传代时加入起始浓度为1μg/ml的嘌呤霉素，设置2-4个浓度梯度且加入嘌呤霉素的浓度逐渐升高，筛选存活的细胞。

7.如权利要求5所述的真核细胞持续进化的控制方法，其特征在于，细胞传代时加入起始浓度为10μg/ml的杀稻瘟菌素，存活的细胞继续下轮进化，设置2-4个浓度梯度且加入杀稻瘟菌素的浓度逐渐升高，筛选存活的细胞。

8.如权利要求5所述的真核细胞持续进化的控制方法，其特征在于，进行细胞传代后加入抗生素，设置2-4个浓度梯度且加入抗生素的浓度逐渐升高，存活的细胞继续下轮进化，每轮进化添加抗生素浓度逐渐提高，抗生素的浓度最高达到300μg/ml来筛选存活细胞。

9.如权利要求1所述的真核细胞持续进化的控制方法，其特征在于，步骤四中的功能验证，包括以下步骤：经过多轮突变后，提取细胞基因组，pcr扩增拟进化区域并连接到进化前的表达载体质粒，进行测序整理出有效的突变体。

10.如权利要求9所述的真核细胞持续进化的控制方法，其特征在于，抗生素筛选浓度达到200μg/ml-300μg/ml时，提取细胞基因组，pcr扩增拟进化区域并连接到进化前的表达载体质粒，进行普通测序整理出有效的突变体，排除掉重复的、移码的突变体和野生型。

11.如权利要求9所述的真核细胞持续进化的控制方法，其特征在于，整理出有效的突变体后，进行步骤四中的功能验证，其中，功能验证包括以下步骤：构建包含突变位点的表达载体，及进化前的野生株在同等条件下在多个细胞系的多个内源性基因的多个位点进行碱基编辑效率试验，通过普通测序或深度测序检测突变体相对野生型的表现。

12.如权利要求11所述的真核细胞持续进化的控制方法，其特征在于，深度测序检测包括编辑效率，编辑窗口，编辑准确性及在dna和rna水平的脱靶率。

13.如权利要求1所述的真核细胞持续进化的控制方法，其特征在于，所述步骤二所得突变体，进化be3后，筛选到以下多个突变体，包括16个突变位点，其中t140a、e146g、l177p均突变为t1，t(aca)80t(acg)、l(ctg)104l(ttg)、y120h均突变为t6，e24g、t140a、e146g均突变为t16，s137p突变为t7，s(tca)137s(tcg)、v139m、r198g均突变为t17，l134s突变为t8，w153c突变为cbe18。

14.按照权利要求1所述的真核细胞持续进化的控制方法其特征在于，所述步骤二所得的突变体，进化abemax后，筛选到以下多个突变体：a1包含氨基酸突变；a11包含氨基酸突变；a19包含y9c，e24e，r25g，r38g，y72c，t110a，n126d，y207c，p251p，a259v，y270y，r295g；a26包含y72c，m150v，k159e，a311t；a23包含n71s，y72c；a14包含k157e，h211r，r295g，s368s，cas9n k30r；m26包含e2g，y9c，y72c，y270c；m10包含y9c，n126d；m14包含r38g,n126d；m19包含r46g，n71s，y72c，n126d，r149g，k...

【专利技术属性】
技术研发人员：王刚，赵娜，周建，
申请(专利权)人：广州大学，
类型：发明
国别省市：