一种假型化病毒载体颗粒制造技术

本发明专利技术涉及包膜糖蛋白突变体以及包膜糖蛋白突变体制备慢病毒并提高病毒产量和滴度,涉及用于将生物材料转移到细胞中的假型化病毒载体颗粒，其中所述载体颗粒至少包含：嵌合包膜糖蛋白，其包含或由长臂猿白血病病毒(GalV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外结构域与鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞质尾结构域的融合体组成,其中胞质尾结构域缺乏融合抑制性R肽；或修饰的GalV包膜糖蛋白，其中胞质尾结构域缺乏融合抑制性R肽。域缺乏融合抑制性R肽。域缺乏融合抑制性R肽。

【技术实现步骤摘要】
一种假型化病毒载体颗粒


[0001]本专利技术属于肿瘤免疫治疗领域。涉及一种具体涉及用突变体GalV糖蛋白提高慢病毒滴度。

技术介绍

[0002]包膜蛋白Env(Envelop)是一种病毒外壳蛋白，它能够介导病毒颗粒附着在宿主细胞表面，进而与宿主细胞膜表面受体融合，在病毒感染宿主细胞过程中发挥重要作用。本专利技术的主要研究对象是长臂猿白血病病毒(Gibbon ape leukemia virus,GalV)的包膜蛋白(GalVEnv)，长臂猿白血病病毒是一种逆转录病毒。
[0003]逆转录病毒的包膜蛋白由胞外区、跨膜区、胞内区组成。胞外区可以和宿主细胞表面受体融合，融合后病毒遗传物质进入宿主细胞中。跨膜区由很短的21个氨基酸组成。当病毒颗粒附着在细胞膜表面时，病毒自身编码的蛋白酶会将胞内区部分约16个氨基酸(R肽)剪切，提高包膜蛋白融合能力，活化的包膜蛋白能够与宿主细胞表面受体融合，病毒遗传物质进入宿主细胞中从而开启了病毒的复制和组装。
[0004]有报道修饰狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜蛋白的胞质尾结构域使其缺乏抑制性R肽，修饰后的BaEV包膜蛋白包装慢病毒后滴度没有明显变化，然而他们是在野生型BaEV包膜蛋白基础上修改的，野生型BaEV包膜蛋白的胞内区不是病毒编码蛋白酶的天然识别序列。GalV包膜蛋白是工业界普遍使用的包膜蛋白，广泛的应用于基础科研和病毒液GMP生产，是基因治疗和细胞治疗的重要工具之一。通过修饰GalV的包膜蛋白，使其胞外区和跨膜区与胞内区病毒编码蛋白酶的天然识别序列融合，并使其缺乏抑制性R肽，能进一步提高病毒产量和滴度，既能够为基础科研应用提供强有力且高效的工具，又能为病毒液工业化生产带来规模化经济效益。有鉴于此，本领域急需改造和优化GalV 的包膜蛋白，提高病毒产量。

技术实现思路

[0005]一方面，本专利技术提供了用于将生物材料转移到细胞中的假型化病毒载体颗粒，其中所述载体颗粒至少包含：
[0006]‑
嵌合包膜糖蛋白，其包含或由长臂猿白血病病毒(GalV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外结构域与鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞质尾结构域的融合体组成,其中胞质尾结构域缺乏融合抑制性R肽；或
[0007]‑
修饰的GalV包膜糖蛋白，其中胞质尾结构域缺乏融合抑制性R肽。
[0008]一方面，本专利技术提供了使用本专利技术的假型化病毒载体颗粒，治疗造血功能障碍或免疫治疗血液瘤和实体瘤的方法。
[0009]另一方面，本专利技术提供了包含作为活性成分的根据本专利技术的假型化病毒载体颗粒的药物。
[0010]另外，本专利技术还涉及根据本专利技术的假型化病毒载体颗粒用于将生物材料离体转移
到造血细胞或免疫淋巴细胞中的用途。
[0011]最后，本专利技术还涉及产生如上述定义的假型化病毒载体颗粒的稳定病毒包装细胞系。
[0012]专利技术详述
[0013]假型化病毒载体颗粒
[0014]本专利技术涉及用于将生物材料转移到细胞中的假型化病毒载体颗粒，其中所述载体颗粒至少包含：
[0015]‑
嵌合包膜糖蛋白，包含或由长臂猿白血病病毒(GalV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外结构域与鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞质尾结构域的融合体组成；或
[0016]‑
修饰的GalV包膜糖蛋白，其中胞质尾结构域缺乏融合抑制性R肽。
[0017]在逆转录病毒重组包装时使用来自逆转录病毒的核心蛋白gag和pol基因编码的蛋白。gag基因编码由逆转录病毒蛋白酶进一步加工成包含核心的结构蛋白的多蛋白。pol基因编码逆转录病毒蛋白酶、逆转录酶和整合酶，本专利技术使用的Gag和pol都是来源于MLV，当Gag和pol中的蛋白酶识别包膜蛋白胞内区后剪切包膜蛋白使其具有融合能力。GalV的包膜蛋白胞外区和跨膜区与MLV包膜蛋白胞内区融合后会提高蛋白酶识别剪切的效率。
[0018]如本文所预期，术语“载体颗粒”是指易于在其表面显示嵌合包膜糖蛋白或修饰的GalV包膜糖蛋白并可逆地结合生物材料的任何颗粒。优选的是，此类载体颗粒是病毒载体颗粒，特别是逆转录病毒载体颗粒。优选地，所述逆转录病毒载体颗粒选自癌病毒载体颗粒，包括鼠白血病病毒(MLV)、禽白血病病毒(ALV)、呼吸道合胞病毒(RSV)或Mason
‑
Pfizer猴病毒(MPMV)载体颗粒；慢病毒载体颗粒，诸如人免疫缺陷病毒(HIV)，例如HIV
‑
1或HIV
‑
2、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马感染性贫血病毒(EIAV)和山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)载体颗粒；和泡沫病毒载体颗粒，诸如人泡沫病毒(HFV)载体颗粒。
[0019]慢病毒载体颗粒是本领域技术人员众所周知的，且特别在Naldini等人(2000)Adv.Virus.Res.55： 599
‑
609和Negre等人(2002)Biochimie84：1161
‑
1171中描述。通常，根据本专利技术的慢病毒载体颗粒至少包含以下组分：(i)包膜组分，其由与包膜蛋白结合的磷脂双分子层构成，其中所述包膜蛋白至少包含上述定义的嵌合或修饰的糖蛋白，所述包膜环绕(ii)由gag蛋白结合构成的核心组分，所述核心本身环绕(iii)通常由核糖核酸(RNA)构成的基因组组分和(iv)酶组分(pol)。所述生物材料可以存在于包膜内、核心内和/或基因组组分内。
[0020]慢病毒载体颗粒可以容易地由本领域技术人员，例如，通过遵循由Sandrin等人(2002)Blood100： 823
‑
832提供的通用指导来制备。简而言之，慢病毒载体颗粒可通过在所谓生产细胞(例如293T人胚胎肾细胞)中表达包装元件(即核心和酶组分)、基因组组分和包膜组分来生成。通常可以采用3 至4种质粒，但数目可以根据慢病毒组分被分解成单独单元的程度而更多。
[0021]如本文中所使用，术语“假型化病毒载体”是指包含外来病毒包膜糖蛋白的病毒载体。通常，根据本专利技术的病毒载体用上文定义的嵌合或修饰的糖蛋白假型化。
[0022]在本专利技术的上下文中，术语“GalV包膜糖蛋白”是指GalV包膜糖蛋白的野生型形式。如技术人员已知的，GalV包膜糖蛋白由胞质尾结构域、跨膜结构域和胞外结构域构成。包膜糖蛋白序列中对应于胞质尾结构域、跨膜结构域和胞外结构域的区域可以由技术人员
容易地确定。通常，胞质尾结构域位于野生型GalV包膜糖蛋白的氨基酸530至564之间。优选地，GalV包膜糖蛋白的野生型胞质尾结构域包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：3组成。
[0023]在本专利技术的上下文中，术语“MLV包膜糖蛋白”是指MLV包膜糖蛋白的野生型形式.包膜糖蛋白序列中对应于胞质尾结构域的区域可以由技术人员容易地确定。通常，MLV包膜糖蛋白的胞质尾结构域位于野生型MLV包膜糖蛋白的氨基酸622至654之间。因此，在一个特别优选的实施方案中，包含或由Ga本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于将生物材料转移到细胞中的假型化病毒载体颗粒，其中所述载体颗粒至少包含：(1)嵌合包膜糖蛋白，其包含由长臂猿内源性白血病病毒(GalV)包膜糖蛋白的胞外结构域和跨膜结构域与鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞质尾结构域的融合体组成,其中胞质尾结构域缺乏融合抑制性R肽，所述GalV的胞外结构域如SEQ ID NO:1所示，所述GalV的跨膜结构域如SEQ ID NO:2所示，所述MLV的胞质尾结构域如SEQ ID NO:5所示，所述融合抑制性R肽的序列包括SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6；或(2)修饰的GalV包膜糖蛋白，其包括长臂猿内源性白血病病毒(GalV)的胞外和跨膜结构域，所述胞外结构域如SEQ ID NO:1所述，所述跨膜结构域如SEQ ID NO:2所示，所述包膜糖蛋白的胞质尾结构域如SEQ ID NO:7所述，并且胞质尾结构域缺乏融合抑制性R肽，所述融合抑制性R肽的序列包括SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6。2.根据权利要求1所述的假型化病毒载体颗粒，其是慢病毒载体颗粒。3.根据权利要求2所述的慢病毒载体颗粒，其选自HIV或SIV。4.根据权利要求1所述的生物材料，其是一种或多种核酸。5.根据权利要求1所述的假型化病毒载体颗粒，其可能包含或表达其他外源核酸。6.根据权利要求1
‑
5任一项所述的假型化病毒载体颗粒，其被用于将生物材料转移入造血细胞或免疫淋巴细胞。7.根据权利要求1
‑
5任一项所述的假型化病毒载体颗粒，其被用于治疗造血功能障碍或自身免疫性疾病或免疫细胞治疗血液瘤和实体瘤。8.根据权利要求7所述的造血功能障碍，其包含范可尼贫血、血友病、β
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地中海贫血、Wiskott
‑
Aldrich综合症、X
‑
连锁重症联合免疫缺陷、腺苷脱氨酶缺乏症、慢性肉芽肿病和肾上腺脑白质营养不良。9.一种用于产生假型化病毒载体颗粒的方法，其包括a)用以下物质转染细胞以得到生产细胞：(i)至少一种第一核酸序列，包含具有包装能力的慢病毒衍生的基因组，如人免疫缺陷病毒(HIV)，例如HIV
‑
1或HIV
‑
2、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马感染性贫血病毒(EIAV)和山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)载体颗粒；和(ii)至少一种第二核酸序列，包含编码来自所述逆转录病毒的核...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘翔，杨艳梅，云小玲，赵威，
申请(专利权)人：上海恒润达生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：