靶向GPC3嵌合抗原受体制造技术

本发明专利技术涉及靶向GPC3的嵌合抗原受体及其用途。具体而言，本发明专利技术提供一种多核苷酸序列，选自：(1)含有依次连接MASK编码序列、抗GPC3单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。本发明专利技术还提供相关的融合蛋白、含所述编码序列的载体，以及所述融合蛋白、编码序列、载体的用途。

Targeting GPC3 chimeric antigen receptor

【技术实现步骤摘要】
靶向GPC3嵌合抗原受体
本专利技术属于嵌合抗原受体领域，具体涉及靶向GPC3嵌合抗原受体及其用途。
技术介绍
肝癌在世界上最流行的肿瘤中位居第五并且在癌症相关死亡的最常见原因中位居第三(Bosch等，Gastroenterologyl27:S5-Sl6，2004；El–Serag等，Gastroenterologyl32:255776，2007)。根据美国癌症学会，肝细胞癌(HCC)占肝癌病例的约75％，往往直到晚期肝癌才会有症状。外科手术是肝癌的标准治疗，因为这种类型的癌症对大多数的化疗药物反应不好。因此，迫切需要开发具有不同作用机制的新药物。磷脂酰肌醇蛋白多糖3(Glypican3，GPC3)是一种细胞表面蛋白，属于硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族。GPC3基因编码产生70kDa左右的前体核心蛋白，该前体蛋白能够被弗林蛋白酶(furin)剪切产生40kDa左右的可溶性的能够进入血液的氨基端(N末端)肽和30kDa左右含有2个硫酸乙酰肝素(HS)糖链的膜结合的竣基端(C末端)肽(Capurro等，DevCe1114:700711，2008；Capurro等，CancerRes65:6245-6254，2005)。GPC3高度表达于胎儿肝脏，而不表达于正常成年人的肝组织，但在肝细胞肝癌中恢复表达，与肝癌的发生发展有十分密切的关系，不仅在肝癌发生的早期检出率较高，而且随着肝癌的发展，其检出率也随之增高。而GPC3的表达在肝腺癌，胆管细胞癌，肝转移癌和12种常见实体瘤和21种非肝癌细胞系中均未检测出。此外，GPC3也在例如黑色素瘤，卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤等肿瘤中表达。考虑到GPC3在肝细胞肝癌，黑色素瘤等肿瘤中特异性的高表达，其被认为是肿瘤免疫治疗的一个候选靶标。嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor-Tcell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。特异性识别人GPC3的C末端表位的单克隆抗体己被公开在如，中国专利文献CN101186650A。此外据文献AdvancesinLiverCancerAntibodyTherapies:AFocusonGlypican3andMesothelin，BioDrugs，2011年10月1日，25(5)：275-284)，其他己知特异性识别C末端表位的单克隆抗体包括GC33，其针对GPC3的抗原决定簇位于C端524-563位氨基酸残基。15例患者的GPC3-GC33抗体在治疗HCC的I期临床试验中观察到明显的治疗效果，推测裸的抗体在对抗人的肝癌不能起到很好的疗效。一个关于GPC3衍生肽疫苗的I期临床试验所获得的结果显示，肝癌患者的中位总生存期与GPC3特异性CTL的频率呈正相关，这项研究表明GPC3针对性的T细胞可能是肝癌治疗潜在靶标。我们专利是以GPC3-GC33的scFV的重链和轻链作为CAR的结构，同时也引入了mask结构。本专利技术制备的CART细胞带有Mask序列，当进入实体瘤肿瘤微环境内因其具有蛋白酶能把Mask序列切割掉暴露出抗GPC3单链抗体使其发挥作用。
技术实现思路
在一些实施方案中，公开了嵌合抗原受体，其包括：(a)scFv，其包含GC33抗体的轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)，其中scFv特异性结合GPC3；(b)来自CD8的铰链和跨膜结构域；(c)细胞内4-1BB信号传导结构域；(d)细胞内CD3ζ信号传导结构域，其中(a)-(d)是N末端至C末端的顺序。本专利技术第二方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列。本专利技术第三方面提供一种病毒，其中病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。本专利技术第四方面提供一种细胞，所述细胞为载体转导的CD3+T细胞或天然杀伤细胞。本专利技术第五方面提供一种药物组合物，所述药物组合其包含有效量的的载体或治疗有效量的CD3+T细胞和/或天然杀伤细胞和药学上可接受的载体。在一个或多个实施方案中，所述GPC3介导的疾病为肝癌。附图说明图1：mask-GPC3-CAR逆转录病毒表达载体示意图。具体实施方式GPC3嵌合抗原受体的构建及逆转录病毒库的制备:已经报道了抗人GPC3单克隆抗体GC33其分子构型如图1所示。CD8铰链和跨膜结构域，4-1BB(CD137)信号传导模块和CD3ζ信号传导模块的氨基酸序列分别衍生自登录号NM_001768，U03397.1和NM_00734，其通过引用并入本文。将各个结构域序列组装成一个转录/翻译单元，并从头合成功能单元的密码子优化的DNA序列。本专利技术通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本专利技术决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。实施例1：GPC3CAR基因序列的确定从NCBI网站数据库搜索到抗GPC3抗体重链和轻链可变区基因序列信息(GC33)，序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。各基因核苷酸和氨基酸序列信息见(SEQUNCEIDNO.1-2)将上述序列依次进行连接，在各序列连接处引入不同酶切位点，形成完整GPC3CAR基因序列信息。实施例2：包含CAR分子的核酸序列的病毒载体的构建将实施例1中制备的CAR分子的核苷酸序列经NotI(NEB)和EcoRI(NEB)双酶切、经T4连接酶(NEB)连接插入逆转录病毒RV载体的NotI-EcoRI位点，转化到感受态E.coli(DH5α)，将重组质粒送上海生工生物技术有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的GPC3CAR序列比对来验证序列是否正确。测序引物为：正义序列:AGCATCGTTCTGTGTTGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.嵌合抗原受体，包括：/n(a)包含轻链可变结构域(V

【技术特征摘要】
1.嵌合抗原受体，包括：
(a)包含轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)的细胞外scFv，其中scFv特异性结合GPC3；
(b)CD8的铰链和跨膜结构域；
(c)细胞内4-1BB信号传导结构域；和
(d)细胞内CD3ζ信号传导结构域，其中(a)-(d)是N-末端至C-末端顺序。


2.权利要求1所述的核酸分子，其中scFv包含接头。其包含SEQIDNO：1的核酸序列。


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【专利技术属性】
技术研发人员：王海鹰，
申请(专利权)人：上海恒润达生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31