一种百日咳丝状血凝素融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种百日咳丝状血凝素融合蛋白及其应用，所述融合蛋白以百日咳FHA氨基酸残基1877‑2250片段和StxB通过肽链连接构成，并以融合蛋白来构建亚单位疫苗，并在大肠杆菌中成功诱导表达，通过Western‑blot和ELISA鉴定了该融合蛋白的免疫原性；免疫小鼠后发现能产生高水平的抗体效价，为百日咳疫苗的研究提供了新思路。

A fusion protein of pertussis filamentous hemagglutinin and its application

【技术实现步骤摘要】
一种百日咳丝状血凝素融合蛋白及其应用
本专利技术涉及生物
，具体的说，涉及一种百日咳丝状血凝素融合蛋白及其应用。
技术介绍
百日咳是由百日咳博德特氏菌引起的急性呼吸道传染病，是一种相对较新的人类传染病之一。这种疾病最早于1414年在法国出现，也是世界上使用疫苗控制效果最差的可预防疾病之一。百日咳的临床特征在于阵发性或爆发性的多次快速咳嗽，并伴有特征性的“鸡鸣”样吸气性吼声，最常见的并发症是继发性肺炎。该病多发于儿童及婴幼儿年龄段，特别是那些小于6个月的婴儿。尽管目前已有针对百日咳的预防性疫苗且疫苗的接种率高，但百日咳仍然是儿童死亡的主要病因之一。天然的丝状血凝素(filamentoushaemagglutinin,FHA)是在细菌细胞表面表达的百日咳博德特氏菌粘附素，也会被分泌到细胞外环境中，它包含几个促进细菌粘附于纤毛呼吸道上皮细胞的结构域，包括保守的三肽序列RGD(Arg-Gly-Asp)，碳水化合物识别结合域和肝素结合域。FHA通过RGD与巨噬细胞和其他细胞表面的3型补体受体(Type3complementreceptor,CR3)结合来启动吞噬作用，然后毒素介导的细胞内杀伤抑制作用可促进细菌存活。为探究FHA最具免疫原性的区域，Asgarian-Omran等人通过人血清抗体对FHA不同区域的测定证明了在FHA氨基酸残基1877-2250位置能够诱导最有效的免疫应答，是FHA的最具免疫显性区域。志贺毒素B亚单位(shigatoxinBsubunit,StxB)早期就被证实可作为载体蛋白在轮状病毒抗原刺激小鼠后提供保护性粘膜体液和细胞免疫反应。StxB作为抗原载体与特定细胞表面受体结合，使DC细胞以受体介导的内吞方式高效摄取抗原蛋白，显著活化初始T细胞进行增殖。同时StxB还为抗原提供了更加复杂的结构，更利于抗原提呈及淋巴结引流，有效诱导机体的免疫应答。因此在疫苗研发领域，StxB成为亚单位疫苗有效载体之一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种能产生高水平的抗体效价的百日咳丝状血凝素融合蛋白，为百日咳疫苗的研究提供了新思路。本专利技术提供一种蛋白质，所述蛋白质为a)或b)或c)或d)：a)由SEQIDNo.2的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQIDNo.2第37-503位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；d)将SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白质。其中，SEQIDNo.2由511个氨基酸残基组成，第1-36位为pET28a(+)上相应序列编码的氨基酸序列，第37-126位为StxB,第127-130位为连接肽,第131-503位为Fha1877-2250，第504-511位为pET28a(+)上相应序列编码的氨基酸序列。a)的蛋白质名称为His-StxB-Fha1877-2250，b)的蛋白质名称为StxB-Fha1877-2250。本专利技术还要求保护与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B12)中的任一种：B1)编码所述蛋白质的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系。上述产品中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，B1)为如下1)或2)或3)或4)所示的基因：1)编码序列是SEQIDNo.1所示的DNA分子；2)编码序列是SEQIDNo.1的第109-1509位所示的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质。SEQIDNo.1由1536个核苷酸组成，第1-108位为pET28a(+)上的序列，第109-378位为StxB基因,第379-390位为连接肽基因,第391-1509位为Fha1877-2250基因，第1510-1536位为pET28a(+)上的序列。a)的基因名称为His-StxB-Fha1877-2250基因，b)的基因名称为StxB-Fha1877-2250基因。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述生物材料中，B2)所述的含有编码StxB-Fha1877-2250的核酸分子的表达盒(StxB-Fha1877-2250基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达StxB-Fha1877-2250的DNA，该DNA不但可包括启动StxB-Fha1877-2250基因转录的启动子，还可包括终止StxB-Fha1877-2250转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本专利技术的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。可用现有的动物表达载体构建含有所述StxB-Fha1877-2250基因表达盒的重组表达载体。制备所述蛋白质的方法，包括使蛋白质的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质的步骤；所述生物为微生物、植物或非人动物。其中，所述使蛋白质的编码基因在生物中进行表达包括将所述蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述蛋白质。其中，所述重组微生物为将pET28a-StxB-Fha1877-2250导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQIDNo.2的蛋白质的重组微生物，所述重组微生物命名为BL21(DE3)/pET28a-StxB-Fha1877-2250，所述pET28a-StxB-Fha1877-2250为将载体pET28a(+)的EcoRI和XhoI位点之间的序列替换为SEQIDNo.1第109-1509位所示的DNA片段得到的重组载体。其中，所述表达为诱导表达。本专利技术还提供一种预防动物百日咳的疫苗，所述疫苗包含所述的蛋白质或所述的生物材料。所述蛋白质按照所述的方法制备；所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：1)编码序列是SEQIDNo.1所示的DNA分子；2)编码序列是SEQIDNo.1的第109-1509位所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为a)或b)或c)或d)：/na)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；/nb)氨基酸序列是SEQ ID No.2第37-503位的蛋白质；/nc)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；/nd)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同活性的蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为a)或b)或c)或d)：
a)氨基酸序列是SEQIDNo.2的蛋白质；
b)氨基酸序列是SEQIDNo.2第37-503位的蛋白质；
c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；
d)将SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同活性的蛋白质。


2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B12)中的任一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系。


3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)所示的基因：
1)编码序列是SEQIDNo.1所示的DNA分子；
2)编码序列是SEQIDNo.1的第109-1509位所示的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。


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【专利技术属性】
技术研发人员：王恒樑，朱力，潘超，刘兆禄，吴军，孙鹏，王斌，曾明，冯尔玲，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11