诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白、表达载体、制备方法、VLPs及应用技术

本发明专利技术涉及一种诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白、表达载体、制备方法、VLPs及应用，该诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白，所述外源肽段为5‑24个氨基酸长度的多肽，外源肽段融合在VP1蛋白的N端。该诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白可自组装成大小均一的诺如病毒的VLPs。

The fusion of norovirus with VP1 protein, expression vector, preparation method, VLPs and Application

【技术实现步骤摘要】
诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白、表达载体、制备方法、VLPs及应用
本专利技术属于诺如病毒VP1蛋白
，具体涉及一种诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白、表达载体、制备方法、VLPs及应用。
技术介绍
诺如病毒（Noroviruses,NoVs）是引起急性非细菌性腹泻的主要病毒体，可以感染各年龄段人群[AhmedS,HallA,RobinsonA,VerhoefL,PremkumarP,ParasharU,etal.Globalprevalenceofnorovirusincasesofgastroenteritis:asystematicreviewandmeta-analysis.LancetInfectDis.2014;14(8):725-30]。世界范围内约50%的病毒性腹泻病例是由NoVs引起。在美国，NoVs每年引起超过2100万感染病例，导致约800人死亡[AJH,BAL,DCP,MMP,PAG,JV,etal.NorovirusdiseaseintheUnitedStates.Emerginginfectiousdiseases.2013;19(8):1198-205]。在中国，NoVs仅次于轮状病毒，引起的病毒性腹泻病例数占比约10-20%[JY,HJ,SL,WX,ML,JW,etal.EtiologyofdiarrheaamongchildrenundertheagefiveinChina:Resultsfromafive-yearsurveillance.TheJournalofinfection.2015;71(1):19-27]。NoVs属于杯状病毒科，诺如病毒属单正链RNA病毒，5′端有共价结合的病毒编码蛋白（viruscodedprotein,VPg），3′端有多聚A尾巴，基因组全长7.5-7.7kb。人NoVs基因组含有三个开放阅读框(openreadingframe,ORF)，从5′端非编码区到3′端非编码区分别为ORF1、2和3。ORF1和ORF2有十几个碱基的重叠，ORF2和ORF3有一个碱基的重叠。ORF1编码一个非结构蛋白前体，在翻译时或者翻译后被3C-样蛋白酶（3CLpro）依次切割为p48、NTPase、p22、VPg、3CLpro和RNA依赖性RNA聚合酶（RNAdependentRNApolymerase，RdRporPol)（N端到C端）。ORF2编码主要衣壳蛋白（majorcapsidprotein,VP1），氨基酸数目530-555不等，分子量在58-60kDa之间。利用重组杆状病毒表达系统以及其它真核或原核表达系统表达的VP1蛋白可以在胞内自组装成形态和免疫原性与野毒株相似的病毒样颗粒（viruslikeparticles,VLPs）[JiangX,WangM,GrahamD,EstesM.Expression,self-assembly,andantigenicityoftheNorwalkviruscapsidprotein.JVirol.1992;66(11):6527-32][HuoY,WanX,LingT,WuJ,WangW,ShenS.ExpressionandpurificationofnorovirusviruslikeparticlesinEscherichiacoliandtheirimmunogenicityinmice.MolImmunol.2018;93:278-84]。ORF3编码次要衣壳蛋白（minorcapsidprotein,VP2），其功能目前尚不清楚，但研究表明与VP1共表达后它可以增强组装VLPs的稳定性，以及提高VP1的表达量[Bertolotti-CiarletA,CrawfordS,HutsonA,EstesM.The3'endofNorwalkvirusmRNAcontainsdeterminantsthatregulatetheexpressionandstabilityoftheviralcapsidproteinVP1:anovelfunctionfortheVP2protein.JVirol.2003;77(21):11603-15]。VP2蛋白具有较多的碱性氨基酸，可能在基因组包装过程中起重要作用。根据VP1氨基酸序列的不同可以将NoVs分为至少7种不同的基因组（genogroup，GI-GVII），每种基因组又可以继续分为多种不同的基因型（gneotype）[VinjéJ.Advancesinlaboratorymethodsfordetectionandtypingofnorovirus.JClinMicrobiol.2015;53(2):373-81]。感染人类的大部分分离株属于GI和GII[VinjéJ.Advancesinlaboratorymethodsfordetectionandtypingofnorovirus.JClinMicrobiol.2015;53(2):373-81]，其中GII.4是目前的主要流行株，引起了约80%的感染病例。虽然近年来NoVs研究取得了显著的进展，如发现肠道细菌可以促进NoVs感染B细胞，鼠源性NoV蛋白受体的发现以及体外NoVs培养方法的建立等等，但NoVs的基因和抗原多样性仍然给疫苗和药物研发带来了巨大挑战[MKJ,MW,SZ,CLG,LRK,KRG,etal.EntericbacteriapromotehumanandmousenorovirusinfectionofBcells.Science(NewYork,NY).2014;346(6210):755-9][RCO,CBW,JGD,MTB,BTM,YCL,etal.Discoveryofaproteinaceouscellularreceptorforanorovirus.Science(NewYork,NY).2016;353(6302):933-6][JonesM,GrauK,CostantiniV,KolawoleA,deGraafM,FreidenP,etal.HumannoroviruscultureinBcells.NatProtoc.2015;10(12):1939-47]。这主要是因为根据现有的临床研究数据，不同型别的NoVs免疫之后不具有交叉保护作用，且NoVs变异较快，这就要求研发疫苗需要涵盖尽可能多的不同亚型流行株，并根据流行情况实时更新加入新的变异株，这和流感病毒相似。考虑到NoVs感染的自限性和严重程度，高成本对NoVs疫苗研发可能不利。此外，目前还不能体外对NoVs进行高滴度培养，无法有效的进行体外药物筛选试验和药物有效性验证试验。在细胞水平上也还没有发现人NoVs特异性的蛋白受体，目前公认的人组织血型抗原（histo-bloodgroupantigens,HBGAs）被认为是NoVs的受体或共受体。结构生物学是一种通过物理学方法研究生物大分子结构的一门学科，已经成为当前生命科学的前沿和带头学科。从电子显微镜到冷冻电子显微镜，再到X-射线晶体衍射技术，人们对物质的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白，其特征在于，所述外源肽段为5-24个氨基酸长度的多肽，外源肽段融合在VP1蛋白的N端。/n

【技术特征摘要】
1.诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白，其特征在于，所述外源肽段为5-24个氨基酸长度的多肽，外源肽段融合在VP1蛋白的N端。


2.根据权利要求1所述的诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白，其特征在于，所述外源肽段为7-15个氨基酸长度的多肽。


3.根据权利要求1所述的诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白，其特征在于，所述多肽序列为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示的多肽序列。


4.用于表达如权利要求1所述的诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白的表达载体。


5.如权利要求4所述的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的多肽的编码序列连接到诺如病毒VP1的编码序列5′端进行全合成，合成的融合基因5′端和3′端分别带有SacI和NotI酶切位点，将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast-BacDual载体的polyhedrin启动子下游，制备得到质粒pFBD-VP1。


6.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：霍玉奇，郑礼钧，刘金瑾，
申请(专利权)人：郑州市第六人民医院，
类型：发明
国别省市：河南;41