一种双抗原夹心法检测2019新型冠状病毒抗体的重组蛋白、试纸条及制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种双抗原夹心法检测2019新型冠状病毒抗体的重组蛋白、试纸条及制备方法和应用，属于病毒检测技术领域。本发明专利技术所述双抗原夹心法检测2019新型冠状病毒抗体的重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术所述重组蛋白为2019‑nCoV多个优势表位的融合蛋白，能够制备得到抗原双夹心法2019‑nCoV病毒抗体检测试剂，可实现常温保存，且能够快速、高灵敏度、高通量、低仪器成本、单人份随时检测，操作简便，可大大提高临床使用简便性。

Novel coronavirus antibody detection recombinant protein, test strip and preparation method and application by double antigen sandwich method for detection of 2019 new coronavirus antibodies

【技术实现步骤摘要】
一种双抗原夹心法检测2019新型冠状病毒抗体的重组蛋白、试纸条及制备方法和应用
本专利技术涉及病毒检测
，具体涉及一种双抗原夹心法检测2019新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体的重组蛋白、试纸条及制备方法和应用。
技术介绍
冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒、中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，2019-nCoV是人类分离的第七类冠状病毒。相关疾病监测，发现多起病毒性肺炎病例，均诊断为病毒性肺炎/肺部感染。新型冠状病毒感染人体后一般有3～14天(有个别案例报道最长24天)的潜伏期，潜伏期内可无临床症状，不易发现。目前的证据表明，潜伏期感染者也有传染性，增大了阻断病毒传播的难度。新型冠状病毒感染临床症状主要表现为发热、咳嗽、乏力等非特异症状，与普通感冒难以区分，其确诊依赖实验室诊断技术。目前新型冠状病毒感染诊断主要依赖基于聚合酶链式反应(PCR)或核酸测序检测病毒特异性基因序列来进行。但是核酸诊断需要有特殊的实验室(要求有4个在物理空间上完全相互独立的区域)和数十种配套设备以及专业操作人员(需认证)才能完成，且检测过程操作复杂，需要数小时才能完成；极易产生气溶胶污染，造成假阳性，也存在因为取样不合适造成漏检的情况，因此核酸检测不适合现场大规模开展。免疫学诊断主要是通过抗原抗体免疫反应检测人体感染病毒以后产生的特异性抗体来诊断。免疫学诊断方法具有操作简单、检测速度快、无需特殊场地及(复杂)仪器设备，且敏感性高等优点，适用于现场大规模开展新型冠状病毒感染筛查及诊断工作。免疫学诊断已报道的方法学主要是胶体金法，ELISA等，检测血液中的病毒特异性IgM和IgG抗体，属于间接法，采用抗原和抗人免疫球蛋白二抗构建检测系统，受基质Ig影响比较大，特异性差，灵敏度也不理想。双抗原夹心法灵敏度高，特异性强，但是目前市面上和文献还未有比较理想的针对2019-nCoV的双抗原夹心的原料的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种双抗原夹心法检测2019新型冠状病毒抗体的重组蛋白、试纸条及制备方法和应用。本专利技术所述重组蛋白为2019-nCoV多个优势表位的融合蛋白，能够制备得到抗原双夹心法2019-nCoV病毒抗体检测试剂，可实现常温保存，且能够快速、高灵敏度、高通量、低仪器成本、单人份随时检测，操作简便，可大大提高临床使用简便性。本专利技术提供了一种双抗原夹心法检测2019新型冠状病毒抗体的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了一种双抗原夹心法检测2019新型冠状病毒抗体的试纸条，包括底板以及依次搭接粘贴在底板上的样品吸收垫、荧光微球垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述荧光微球垫喷涂有荧光微球标记的2019新型冠状病毒多优势表位融合蛋白，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，所述检测区喷涂有2019新型冠状病毒多优势表位融合蛋白，所述质控区喷涂有抗N蛋白抗体；所述2019新型冠状病毒多优势表位融合蛋白为上述技术方案所述的重组蛋白。优选的是，所述试纸条检测的样本包括唾液、尿液、血清、血浆和全血样本。优选的是，所述试纸条还包括样本稀释液；所述样本稀释液包括PB溶液和Tween-20；所述PB溶液的浓度为0.008～0.012mol/L；所述样本稀释液中Tween-20的体积含量为0.4％～0.6％。优选的是，所述荧光微球为聚苯乙烯包裹稀土离子Eu+的微球，所述荧光微球表面有羧基基团。优选的是，所述荧光微球的直径为100～300nm。本专利技术还提供了上述技术方案所述试纸条的制备方法，包括以下步骤：1)将活化的荧光微球与上述技术方案所述重组蛋白混合偶联，获得荧光微球标记的2019新型冠状病毒多优势表位融合蛋白；2)将所述荧光微球标记的2019新型冠状病毒多优势表位融合蛋白喷涂至玻璃纤维膜上获得荧光微球垫；3)将2019新型冠状病毒多优势表位融合蛋白和抗N蛋白抗体分别喷涂在硝酸纤维素膜的检测区和质控区获得固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜；4)在底板上依次搭接地粘贴样品吸收垫、荧光微球垫、固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜和吸水垫，获得试纸条。优选的是，所述活化的荧光微球的制备方法包括以下步骤：将荧光微球与交联剂和活化缓冲液混合震荡20～40min，得到活化的荧光微球。本专利技术还提供了上述技术方案所述重组蛋白或上述技术方案所述试纸条在制备2019新型冠状病毒检测试剂中的应用。本专利技术提供了一种双抗原夹心法检测2019新型冠状病毒抗体的重组蛋白。本专利技术中所述重组蛋白为多优势抗原表位融合蛋白，能够与新型冠状病毒2019-nCoV抗体特异性结合，能更好、更全的捕获抗体，通过检测样本中的抗病毒抗体含量可以在早期诊断是否感染新型冠状病毒。本专利技术所述重组蛋白制备得到的双抗原夹心试纸条能够快速、准确的检测新型冠状病毒2019-nCoV抗体，可用于唾液、尿液、血清、血浆、全血样本的检测，检测时间低于15min，特异性更高，能够更准确、更灵敏的检测抗病毒抗体，有利于新型冠状病毒的防控、治疗工作。相比于现有方法，本专利技术采用了一种全新的方法学实现2019新型冠状病毒抗体的检测，具有检测仪器成本低，操作简便，快速，可常温储存运输，适用于多种类型样本(唾液、尿液、血清、血浆、全血)，稳定性好(核酸为冷藏试剂)，特异性高(双抗原夹心法相比于间接法测病毒抗体，不受样本中大量无关Ig的影响，因此特异性高)，灵敏度高(制备的2019nCoV蛋白多优势表位融合蛋白，相对于常规的采用N蛋白或者N+S蛋白的间接法，可以检测到针对2019-nCoV病毒的大部分抗体，因此灵敏度更高)，实现早期筛查(高灵敏度可以在早期检测到低浓度的2019-nCoV病毒抗体)。对比RT-PCR法，本专利技术所述方法的优点为，检测环境要求低，检测仪器成本低，避免复杂前处理过程，检测快速15min，样本采集容错率高，可实现高通量检测，单人份包装，稳定性好，重复性高，操作简单无需专业人员。对比测序法，本专利技术所述方法的优点为检测仪器成本低，试剂可常温储存，单人份包装，稳定性好，重复性高，操作简单无需专业人员，检测快速15min。对比胶体金法，ELISA法方法学，本专利技术所述方法的优点：1)对比方法主要采用间接法测定，内源性大量无关Ig同特异性的Ig竞争抗人Ig二抗的结合位点，导致灵敏度下降，非特异性结合多，本专利技术采用双抗原夹心法，待测抗体必须同时结合两种抗原，因此特异性更高；对比方法只能检测IgM和IgG亚型的抗体，而本专利技术可检测到同病毒抗原结合的所有类型抗体(包括IgA，IgM，IgG，IgE)，灵敏度更高，更早检测到病毒抗体的存在；对比方法主要采用病毒的N蛋白或者N蛋白和S蛋白的混合，本专利技术制备了2019-nCoV病毒的多优势表位融合蛋白(来自于N蛋白，S蛋白，M蛋白)，避免了对比方法需要优化不同抗原蛋白的混合比例，并且覆盖更多的表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双抗原夹心法检测2019新型冠状病毒抗体的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种双抗原夹心法检测2019新型冠状病毒抗体的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种双抗原夹心法检测2019新型冠状病毒抗体的试纸条，包括底板以及依次搭接粘贴在底板上的样品吸收垫、荧光微球垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述荧光微球垫喷涂有荧光微球标记的2019新型冠状病毒多优势表位融合蛋白，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，所述检测区喷涂有2019新型冠状病毒多优势表位融合蛋白，所述质控区喷涂有抗N蛋白抗体；所述2019新型冠状病毒多优势表位融合蛋白为权利要求1所述的重组蛋白。


3.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条检测的样本包括唾液、尿液、血清、血浆和全血样本。


4.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条还包括样本稀释液；所述样本稀释液包括PB溶液和Tween-20；所述PB溶液的浓度为0.008～0.012mol/L；所述样本稀释液中Tween-20的体积含量为0.4％～0.6％。


5.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述荧光微球为聚苯乙烯包裹稀土...

【专利技术属性】
技术研发人员：何昆仑，田亚平，张思兵，周建平，周裕军，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，北京丹大生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11