新的重组融合蛋白及其制备和用途制造技术

本发明专利技术提供一种重组融合蛋白，其包含PD‑L1抗体，该PD‑L1抗体的至少一个互补位在重链或轻链的N端通过接头与信号调节蛋白(SIRP)的胞外Ig样结构域连接，其中该重组融合蛋白可以同时与CD47、PD‑L1和FcR结合。还提供编码该重组融合蛋白的多核苷酸、包含该多核苷酸的表达载体、制备该重组蛋白的方法、以及使用重组蛋白来治疗由CD47和/或PD‑L1过表达引起的疾病。

New recombinant fusion protein and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新的重组融合蛋白及其制备和用途专利
本专利技术涉及一种重组融合蛋白、其制备和用途，特别是其在肿瘤治疗中的用途。
技术介绍
癌细胞已经发展出一些逃避宿主免疫监视的机制，包括：1)通过高表达膜蛋白PD-L1和PD-L2来逃避T淋巴细胞的免疫监视，其中膜蛋白PD-L1和PD-L2均与T细胞表面的PD-1结合，引发T细胞凋亡；2)逃避自然杀伤(NK)细胞的免疫监视，NK细胞表面上的NKG2D蛋白，在与癌细胞表面上的MICA/MICB蛋白结合时，可以激活NK细胞来杀死癌细胞，然而，癌细胞已经发展出促进MICA/MICB从癌细胞上脱离的机制，脱离的MICA/MICB与NKG2D结合，阻断其对NK细胞的激活；3)逃避巨噬细胞(Mφ)的免疫监视，几乎所有癌细胞在其表面上表达高水平的CD47，CD47与Mφ表面上的信号调节蛋白α(SIRPα)结合，从而引发抑制性信号的生成，该抑制信性号抑制Mφ对癌细胞的吞噬作用。可以看出，癌细胞相当□聪明□，可以基于它们发展出的逃避机制而迅速增殖。因此，有效杀灭所有癌细胞的抗癌药物的开发需要靶向这些机制。SIRP和CD47信号调节蛋白(SIRP)是跨膜糖蛋白，包括三个家族成员，SIRPα(CD172a)、SIRPβ(CD172b)和SIRPγ(CD172g)。这三种蛋白均包含相似的胞外区域，但是具有不同的胞内结构域。胞外区域包含三个免疫球蛋白样结构域，一个Ig-V和两个Ig-C结构域。SIRPα(CD172a)的胞内结构域包含两个抑制性信号转导区域，其可以抑制信号转导以及相应的细胞功能。SIRPβ(CD172b)和SIRPγ(CD172g)的胞内区域非常短，不含信号转导结构域。但是，SIRPβ(CD172b)能够经由衔接蛋白例如DAP12而起到信号转导的功能。SIRP主要表达在巨噬细胞(Mφ)、树突状细胞(DC)和神经元中。CD47是属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，在包括红细胞在内的所有细胞类型的表面上表达。CD47的配体包括整联蛋白、血小板反应蛋白-1和SIRP。CD47，通过与SIRPα相互作用发出“不要吃我”的信号，可以抑制巨噬细胞的吞噬作用，并从而保护例如血细胞等的细胞免收巨噬细胞的攻击。已经有研究表明，很多过表达CD47的肿瘤或癌细胞，通过与巨噬细胞的细胞表面上的SIRPα结合，防止巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用。过表达CD47的癌细胞包括急性髓细胞样白血病(AML)、慢性髓细胞样白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌和胰腺癌细胞。有报道称，向荷肿瘤的小鼠注射阻碍CD47与SIRPα结合的CD47特异性抗体，可以显著地抑制肿瘤生长。当将同一抗体注射到携带人白血病细胞的小鼠中，肿瘤细胞或癌细胞完全消除(TheocharidesAPA,etal.,2012)。PD-L1和PD-1PD-L1，又称为程序性死亡-配体1或CD274，是一种跨膜蛋白，在一些特定情况例如异体组织移植、自身免疫疾病和肿瘤发生的过程中起到抑制免疫系统的重要作用。在癌症中，丧失转录因子例如STAT3与NF-κB之间的反馈限制将引起局部PD-L1表达的增加，这会限制靶向PD-L1的药物的全身性治疗的有效性(VlahopoulosSA,2017)。对来自肾细胞癌患者的196个肿瘤样本分析发现，肿瘤PD-L1的高表达与增强的肿瘤侵袭性以及增加4.5倍的死亡风险相关(ThompsonRHetal.,2004)。PD-1是长约268个氨基酸的细胞表面受体。当与PD-L1或PD-L2结合时，PD-1可以通过抑制T细胞炎性反应，下调免疫系统，并提高自身耐受性。PD-1对于免疫系统的抑制性作用可防止自身免疫疾病，但也同时阻止免疫系统杀灭癌细胞。一种PD-1抗体，BMS-936558，在大约1/5-1/4的小细胞肺癌、黑色素瘤或肾细胞癌病患中产生客观性缓解(SuzanneL.Topalianetal.,2012)。Fc和FcR可结晶区段(Fc区)是抗体的尾部区，是决定抗体的效应子功能(即，抗体如何与特定细胞受体或其他防御蛋白建立关系)的结构域。Fc受体(FcR)是在某些细胞，包括B淋巴细胞、滤泡树突状细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞、和肥大细胞等的表面上的蛋白。这些细胞有助于免疫系统的保护功能。Fc区可以与Fc受体以及补体系统的一些蛋白相互作用，激活免疫系统。治疗性双特异性或多特异性融合蛋白/抗体靶向单一肿瘤相关抗原的抗体具有有限的疗效。例如，最近批准的PD-L1抗体，Avelumab(BAVENCIO)，总的缓解率仅为33％。因此，已经开发出一些或正在开发一些针对两个或更多个靶点的抗癌药物，但是大多数目前涉及双特异性或多特异性抗体的技术(例如Triomab、CrossMab、DVD-Ig、BiTE、DART和TandAb)有各种缺陷，例如高聚集度、大分子量(>200kDa)和较短的半衰期(<12小时，BiTE、DART和TandAb)，从而降低了其疗效。WO2016/169261公开了一种约90kDa的重组双功能融合蛋白，靶向CD47和FcR，其用于治疗荷HL细胞的Balb/c裸小鼠，且观察到加强的抗肿瘤效果。然而，迄今为止没有报道过任何能够同时精准靶向CD47、PD-L1和FcR且分子量低、半衰期长的单分子药物，而本专利技术满足该需要。
技术实现思路
本专利技术公开一种重组融合蛋白，其包含PD-L1抗体，该PD-L1抗体的至少一个互补位在构成该互补位的重链或轻链的N端经接头与信号调节蛋白(SIRP)的胞外Ig样结构域连接，其中该蛋白可以同时与CD47、PD-L1以及FcR结合。与癌细胞上的CD47结合，可以阻断CD47与巨噬细胞上SIRP的相互作用，因而解除SIRP介导的抑制信号对巨噬细胞的检查；而与癌细胞上的PD-L1结合，可以解除PD-1介导的抑制信号对T细胞的检查；同时，与NK细胞或巨噬细胞上FcR的结合，可以激活NK细胞或巨噬细胞对癌细胞的靶向杀灭。在一个实施方式中，PD-L1抗体的一个互补位在构成该互补位的重链或轻链的N端经接头与信号调节蛋白(SIRP)的胞外Ig样结构域连接。在另一实施方式中，PD-L1抗体的各互补位在构成该互补位的重链或轻链的N端经接头与信号调节蛋白(SIRP)的胞外Ig样结构域连接。在一个实施方式中，PD-L1抗体的各互补位在构成该互补位的重链的N端经接头与信号调节蛋白(SIRP)的胞外Ig样结构域连接。在一个实施方式中，PD-L1抗体的各互补位在构成该互补位的轻链的N端经接头与信号调节蛋白(SIRP)的胞外Ig样结构域连接。在一个实施方式中，PD-L1抗体的一个互补位在构成该互补位的重链的N端经接头与信号调节蛋白(SIRP)的胞外Ig样结构域连接，该PD-L1抗体的另一互补位在构成该互补位的轻链的N端经接头与信号调节蛋白(SIRP)的胞外Ig样结构域连接。在一些实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组融合蛋白，包含PD-L1抗体，该PD-L1抗体的至少一个互补位在重链或轻链的N端经接头与信号调节蛋白(SIRP)的胞外Ig样结构域连接，其中该重组融合蛋白能够同时与CD47、PD-L1以及FcR结合。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171026 US 62/577，7041.一种重组融合蛋白，包含PD-L1抗体，该PD-L1抗体的至少一个互补位在重链或轻链的N端经接头与信号调节蛋白(SIRP)的胞外Ig样结构域连接，其中该重组融合蛋白能够同时与CD47、PD-L1以及FcR结合。


2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中，PD-L1抗体的各互补位在重链或轻链的N端与信号调节蛋白(SIRP)的胞外Ig样结构域连接。


3.根据权利要求2所述的重组融合蛋白，其中PD-L1抗体的各互补位在重链的N端与信号调节蛋白(SIRP)的胞外Ig样结构域连接。


4.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中信号调节蛋白为SIRPα。


5.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中信号调节蛋白的胞外Ig样结构域为SIRPαD1。


6.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中接头为5-30氨基酸残基的短肽。


7.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中接头为–(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3-。


8.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中PD-L1抗体包含两条重链和两条轻链，各重链具有与SEQIDNO：6具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，各轻链具有与SEQIDNO：8具有至少80％、85％、90％、...

【专利技术属性】
技术研发人员：田文志，李松，
申请(专利权)人：宜明昂科生物医药技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31