靶向CD47和CD70的重组融合蛋白及其制备和用途制造技术

本申请提供一种重组融合蛋白，包含CD70抗体或其抗体片段，该CD70抗体或其抗体片段的至少一个互补位在构成该互补位的重链或轻链的N端通过接头与信号调节蛋白(SIRP)的胞外Ig样结构域连接，其中该重组融合蛋白可以同时与CD47、CD70和FcR结合。还提供编码该重组融合蛋白的核酸分子、包含该核酸分子的表达载体、制备该重组融合蛋白的方法、以及使用重组融合蛋白来治疗与CD47和/或CD70过表达相关的疾病。白来治疗与CD47和/或CD70过表达相关的疾病。白来治疗与CD47和/或CD70过表达相关的疾病。

【技术实现步骤摘要】
靶向CD47和CD70的重组融合蛋白及其制备和用途
专利

[0001]本申请涉及一种靶向CD47、CD70和/或FcR的重组融合蛋白、及其制备和用途，特别是其在肿瘤治疗中的用途。

技术介绍

[0002]癌细胞已经发展出一些逃避宿主免疫监视的机制，包括：1)通过高表达膜蛋白PD
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L1和PD
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L2来逃避T淋巴细胞的免疫监视，其中膜蛋白PD
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L1和PD
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L2均与T细胞表面的PD
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1结合，引发T细胞凋亡；2)通过表达CD70，与免疫细胞表面上的CD27结合，诱导T细胞凋亡和T细胞衰竭，大量增加Treg的量；3)通过高表达CD47来逃避巨噬细胞(Mφ)的免疫监视，CD47与巨噬细胞表面上的信号调节蛋白α(SIRPα)结合，从而引发抑制性信号的生成，该抑制信性号抑制巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用。可以看出，癌细胞相当聪明，可以基于它们发展出的逃避机制而迅速增殖。因此，有效杀灭所有癌细胞的抗癌药物的开发可以针对这些机制。
[0003]SIRP和CD47
[0004]信号调节蛋白(SIRP)是跨膜糖蛋白，包括三个家族成员，SIRPα(CD172a)、SIRPβ(CD172b)和SIRPγ(CD172g)。这三种蛋白均包含相似的胞外区域，但是具有不同的胞内结构域。胞外区域包含三个免疫球蛋白样结构域，一个Ig
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V和两个Ig
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C结构域。SIRPα(CD172a)的胞内结构域包含两个抑制性信号转导区域，其可以抑制信号转导以及相应的细胞功能。SIRPβ(CD172b)和SIRPγ(CD172g)的胞内区域非常短，不含信号转导结构域。但是，SIRPβ(CD172b)能够经由衔接蛋白例如DAP12而起到信号转导的功能。SIRP主要表达于巨噬细胞(Mφ)、树突状细胞(DC)和神经元。
[0005]CD47是属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，在包括红细胞在内的所有细胞类型的表面上表达。CD47的配体包括整联蛋白、血小板反应蛋白
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1和SIRP。CD47，通过与SIRPα相互作用发出“不要吃我”的信号，可以抑制巨噬细胞的吞噬作用，并从而保护例如血细胞等免收巨噬细胞的攻击。
[0006]已经有研究表明，很多过表达CD47的肿瘤或癌细胞可以抑制巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用。过表达CD47的癌细胞包括急性髓细胞样白血病(AML)、慢性髓细胞样白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌和胰腺癌细胞。有报道称，向荷肿瘤的小鼠注射阻碍CD47与SIRPα结合的CD47特异性抗体，可以显著地抑制肿瘤生长。当将同一种抗体注射到携带人白血病细胞的小鼠中时，肿瘤细胞或癌细胞完全消除(Theocharides APA,et al.,2012)。
[0007]CD70
[0008]CD70为II形跨膜蛋白(B.F.Israel et al.,2005)，属于肿瘤坏死因子超家族成员，主要表达于高度活化的淋巴细胞、以及树突细胞，在抗原递呈细胞中也发现了CD70的表达。CD70又称为CD27L，可以结合于CD27，一种表达于成熟T细胞、记忆B细胞、生发中心B细胞和自然杀伤细胞(NK)的受体。CD70与CD27的相互作用在激活淋巴细胞和维持免疫应答中发
挥重要作用。CD70
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CD27信号通路可以诱导CD4
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T细胞和CD8
+
T细胞的增殖以及细胞因子的分泌。CD70
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CD27还可促进B细胞活化、增殖及分化，促进生发中心的形成，诱导抗体的分泌。
[0009]大量研究表明，CD70在多种肿瘤组织中表达，包括肾细胞癌、鼻咽癌、Epstein
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Barr病毒诱导的癌症、恶性霍金奇淋巴瘤(HL)(H.J.Gruss et al.,1996)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡状淋巴瘤、B细胞淋巴细胞白血病、Burkitt淋巴瘤(S.M.Lens et al.,1999)、多发性骨髓瘤(J.A.McEarchern et al.,2008)、Waldenstrom巨球蛋白血症(A.W.Ho et al.,2008)、鼻咽癌(A.Agathanggelou et al.,1995)、胸腺癌(T.Hishima et al.,2000)、肾细胞癌(C.L.Law et al.,2006)、胶质母细胞瘤(J.Wischhusen et al.,2002)、脑癌(J.Held
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Feindt et al.,2002)、骨肉瘤(J.H.Pahl et al.,2015)、黑色素瘤(C.Pich et al.,2016)、和卵巢癌(S.Aggarwal et al.,2008)。在B细胞淋巴瘤、肾细胞癌和乳腺癌中，CD70的表达与不良预后相关。一些研究还发现CD70在原发性和转移性非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤细胞表面以及肿瘤微环境中表达，从而使得CD70成为了治疗NSCLC的潜在靶点(J.Jacobs et al.,2015)。
[0010]肿瘤细胞利用其表达的CD70，诱导T细胞凋亡和T细胞衰竭，并大量增加调节性T细胞(Treg)的量，从而促进其自身生长(Julie Jacobs et al.,2018)。例如，在急性髓性细胞样白血病(AML)中，AML细胞中的CD70
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CD27通路可激活干细胞基因表达程序，促进对称细胞分裂和增殖，而抗体阻断可抑制细胞生长(C.Riether et al.,2017)。通过抗体cusatuzumab阻断CD70与CD27相互作用，可大幅减少白血病干细胞(LSC)(C.Riether et al.,2020)。
[0011]Fc和FcR
[0012]可结晶区段(Fc区)是抗体的尾部区，是决定抗体的效应子功能(即，抗体如何与特定细胞受体或其他防御蛋白建立关系)的结构域。
[0013]Fc受体(FcR)是在某些细胞，包括B淋巴细胞、滤泡树突状细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞、和肥大细胞等的表面上的蛋白。这些细胞有助于免疫系统的保护功能。
[0014]Fc区可以与Fc受体以及补体系统的一些蛋白相互作用，激活免疫系统。
[0015]治疗性双特异性或多特异性融合蛋白/抗体
[0016]靶向单一抗原的抗体具有有限的疗效。例如，获批的PD
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L1抗体，Avelumab总的缓解率仅为33％。
[0017]近年来已经开发出双特异性或三特异性融合蛋白，且这些融合蛋白已经在临床前和临床试验中显示出相当不错的效果。
[0018]尽管从概念上讲，在传统抗体上附加额外的结合基团不是很复杂的事，然而，这种改造会显著地改变抗体的结构，抗体和额外结合基团间可能会本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组融合蛋白，包含CD70抗体或其抗体片段、以及CD47结合肽，所述CD70抗体或其抗体片段包含重链可变区、重链恒定区、和轻链可变区，重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：2、3和4所示的HV
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CDR1、HV
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CDR2、和HV
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CDR3，轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：5、6和7所示的LV
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CDR1、LV
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CDR2、和LV
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CDR3，重链恒定区具有FcR结合力且与重链可变区的C端连接，所述CD47结合肽包含信号调节蛋白(SIRP)的胞外Ig样结构域，该信号调节蛋白(SIRP)的胞外Ig样结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述CD70抗体或其抗体片段的各互补位与所述CD47结合肽在构成该互补位的重链可变区或轻链可变区的N端连接，所述重组融合蛋白能够同时与CD47、CD70以及FcR结合。2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述CD70抗体或其抗体片段的各互补位与所述CD47结合肽在构成该互补位的重链可变区的N端连接。3.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述CD70抗体或其抗体片段的各互补位与所述CD47结合肽在构成该互补位的轻链可变区的N端连接。4.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述CD70抗体或其抗体片段经接头与所述CD47结合肽连接。5.根据权利要求4所述的重组融合蛋白，其中接头为
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(Gly
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Gly
‑
Gly
‑
Gly
‑
Ser)3‑
(SEQ ID NO：20)。6.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包含如i)SEQ ID NOs：8和9(X＝N)；或ii)SEQ ID NOs：8和9(X＝E)所示的氨基酸序列。7.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中其中重链恒定区包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。8.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，还包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包...

【专利技术属性】
技术研发人员：田文志，李松，陈典泽，
申请(专利权)人：宜明昂科生物医药技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：