靶向CD47和PD-L1的重组融合蛋白及其制备和用途制造技术

本申请提供一种重组融合蛋白，包含PD

【技术实现步骤摘要】
靶向CD47和PD
‑
L1的重组融合蛋白及其制备和用途
专利

[0001]本申请涉及一种靶向CD47、PD
‑
L1和/或FcR的重组融合蛋白、及其制备和用途，特别是其在肿瘤治疗中的用途。

技术介绍

[0002]癌细胞已经发展出一些逃避宿主免疫监视的机制，包括：1)通过高表达膜蛋白PD
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L1和PD
‑
L2来逃避T淋巴细胞的免疫监视，其中膜蛋白PD
‑
L1和PD
‑
L2均与T细胞表面的PD
‑
1结合，引发T细胞凋亡；2)通过癌细胞膜上MICA/MICB的脱落来逃避自然杀伤(NK)细胞的免疫监视，脱落的MICA/MICB与NK细胞表面的NKG2D结合，阻断NK细胞对MICA/MICB
+
癌细胞的杀灭；3)通过高表达CD47来逃避巨噬细胞(Mφ)的免疫监视，CD47与巨噬细胞表面上的信号调节蛋白α(SIRPα)结合，从而引发抑制性信号的生成，该抑制信性号抑制巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用。可以看出，癌细胞相当聪明，可以基于它们发展出的逃避机制而迅速增殖。因此，有效杀灭所有癌细胞的抗癌药物的开发可以针对这些机制。
[0003]SIRP和CD47
[0004]信号调节蛋白(SIRP)是跨膜糖蛋白，包括三个家族成员，SIRPα(CD172a)、SIRPβ(CD172b)和SIRPγ(CD172g)。这三种蛋白均包含相似的胞外区域，但是具有不同的胞内结构域。胞外区域包含三个免疫球蛋白样结构域，一个Ig
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V和两个Ig
‑
C结构域。SIRPα(CDl72a)的胞内结构域包含两个抑制性信号转导区域，其可以抑制信号转导以及相应的细胞功能。SIRPβ(CD172b)和SIRPγ(CD172g)的胞内区域非常短，不含信号转导结构域。但是，SIRPβ(CD172b)能够经由衔接蛋白例如DAP12而起到信号转导的功能。SIRP主要表达于巨噬细胞(Mφ)、树突状细胞(DC)和神经元。
[0005]CD47是属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，在包括红细胞在内的所有细胞类型的表面上表达。CD47的配体包括整联蛋白、血小板反应蛋白
‑
1和SIRP。CD47，通过与SIRPα相互作用发出“不要吃我”的信号，可以抑制巨噬细胞的吞噬作用，并从而保护例如血细胞等免收巨噬细胞的攻击。
[0006]已经有研究表明，很多过表达CD47的肿瘤或癌细胞可以抑制巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用。过表达CD47的癌细胞包括急性髓细胞样白血病(AML)、慢性髓细胞样白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌和胰腺癌细胞。有报道称，向荷肿瘤的小鼠注射阻碍CD47与SIRPα结合的CD47特异性抗体，可以显著地抑制肿瘤生长。当将同一种抗体注射到携带人白血病细胞的小鼠中时，肿瘤细胞或癌细胞完全消除(Theocharides APA，et al.，2012)。
[0007]PD
‑
L1和PD
‑1[0008]PD
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L1，又称为程序性死亡
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配体1或CD274，是一种跨膜蛋白，在一些特定情况例如异体组织移植、自身免疫疾病和肿瘤发生的过程中起到抑制免疫系统的重要作用。在癌症中，丧失转录因子例如STAT3与NF
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κB之间的反馈限制将引起局部PD
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L1表达的增加，这会限
制靶向PD
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L1的药物的全身性治疗的有效性(Vlahopoulos SA，2017)。对来自肾细胞癌患者的196个肿瘤样本分析发现，肿瘤PD
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L1的高表达与增强的肿瘤侵袭性以及增加4.5倍的死亡风险相关(Thompson RH et al.，2004)。
[0009]PD
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1是长约268个氨基酸的细胞表面受体。当与PD
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L1或PD
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L2结合时，PD
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1可以通过抑制T细胞炎性反应，下调免疫系统，并提高自身耐受性。PD
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1对于免疫系统的抑制性作用可防止自身免疫疾病，但也同时阻止免疫系统杀灭癌细胞。一种PD
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1抗体，BMS
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936558，在大约1/5
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1/4的小细胞肺癌、黑色素瘤或肾细胞癌病患中产生客观性缓解(Suzanne L.Topalian et al.，2012)。
[0010]Fc和FcR
[0011]可结晶区段(Fc区)是抗体的尾部区，是决定抗体的效应子功能(即，抗体如何与特定细胞受体或其他防御蛋白建立关系)的结构域。
[0012]Fc受体(FcR)是在某些细胞，包括B淋巴细胞、滤泡树突状细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞、和肥大细胞等的表面上的蛋白。这些细胞有助于免疫系统的保护功能。
[0013]Fc区可以与Fc受体以及补体系统的一些蛋白相互作用，激活免疫系统。
[0014]治疗性双特异性或多特异性融合蛋白/抗体
[0015]靶向单一抗原的抗体具有有限的疗效。例如，获批的PD
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L1抗体，Avelumab总的缓解率仅为33％。
[0016]近年来已经开发出双特异性或三特异性融合蛋白，且这些融合蛋白已经在临床前和临床试验中显示出相当不错的效果。
[0017]尽管从概念上讲，在传统抗体上附加额外的结合基团不是很复杂的事，然而，这种改造会显著地改变抗体的结构，抗体和额外结合基团间可能会相互影响结合力和/或药效(Wang S et al.，2021)。为优化体内疗效和药物性质，需要在主次基团(序列)的选择、目标物结合力的平衡、结合位点(重链或轻链的N
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或C
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端)的选择、结构稳定性、接头长度和序列方面做出精心的设计和改造(Shim H.2020)。
[0018]US 10,800,821 B2公开了一种约90k道尔顿的重组双特异性融合蛋白，靶向CD47和FcR，在治疗携带HL细胞的Balb/c裸鼠中观察到增强的抗肿瘤效果。US 10,973,878 B2公开了一种同时靶向CD47、PD
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L1和FcR的融合蛋白IMM2505，其具有低分子量和较长的半衰期。
[0019]对于本申请中任何文件的引用，并不等同于承认这些文件是本申请的现有技术。

技术实现思路

[0020]本申请提供一种新的重组融合蛋白，与10,973,878 B2中的IMM2505结构相似，但具有新的PD
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L1抗体序列，显示出比IMM2505更优的抗肿瘤效果。
[0021]具体地，本申请公开一种重组融合蛋白，其包含特异结合PD
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组融合蛋白，包含PD
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L1抗体或其抗体片段、以及CD47结合肽，其中所述PD
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L1抗体或其抗体片段包含重链可变区、重链恒定区、和轻链可变区，重链可变区包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列，重链恒定区具有FcR结合力且与重链可变区的C端连接，其中所述CD47结合肽包含信号调节蛋白(SIRP)的胞外Ig样结构域，该信号调节蛋白(SIRP)的胞外Ig样结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其中所述PD
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L1抗体或其抗体片段的各互补位与所述CD47结合肽在构成该互补位的重链可变区或轻链可变区的N端连接，所述重组融合蛋白能够同时与CD47、PD
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L1以及FcR结合。2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述PD
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L1抗体或其抗体片段的各互补位与所述CD47结合肽在构成该互补位的重链可变区的N端连接。3.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述PD
‑
L1抗体或其抗体片段的各互补位与所述CD47结合肽在构成该互补位的轻链可变区的N端连接。4.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述PD
‑
L1抗体或其抗体片段经接头与所述CD47结合肽连接。5.根据权利要求4所述的重组融合蛋白，其中接头为
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(Gly
‑
Gly
‑
Gly
‑
Gly
‑
Ser)3‑
(SEQ ID NO：4)。6.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中重链恒定区包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列。7.根据权利要求2所述的重组融合蛋白，还包含轻链恒定区，其中所述重组融合蛋白包含具有S...

【专利技术属性】
技术研发人员：田文志，李松，
申请(专利权)人：宜明昂科生物医药技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：