本发明专利技术提供了一种甘精胰岛素衍生物及其制备方法。具体地，本发明专利技术提供了包含绿色荧光蛋白折叠单元和甘精胰岛素或其活性片段的融合蛋白。本发明专利技术的融合蛋白表达量显著提高，融合蛋白中的甘精胰岛素蛋白折叠正确，具有生物活性。并且，本发明专利技术融合蛋白中的绿色荧光蛋白折叠单元可以被蛋白酶消化成小片段，和目的蛋白相比分子量差别大，容易分离。本发明专利技术还提供了利用该融合蛋白制备甘精胰岛素的方法及制备中间体。备中间体。
【技术实现步骤摘要】
一种甘精胰岛素衍生物及其应用
[0001]本专利技术涉及生物
，更具体地涉及一种甘精胰岛素衍生物及其应用。
技术介绍
[0002]糖尿病是全球范围内威胁人类健康的一大疾病。在中国，随着人民生活方式的改变和老龄化进程的加快，糖尿病的患病率呈快速上升趋势。糖尿病的急慢性并发症，尤其是慢性并发症累计多个器官，致残、致死率高，严重影响患者的身心健康，并给个人、家庭和社会带来沉重的负担。
[0003]甘精胰岛素通过改变重组人甘精胰岛素的氨基酸和略微调整配方以达到作用维持时间长的目的。甘精胰岛素是以电荷中性的甘氨酸取代人胰岛素A链21位置天冬酰胺，使六聚体更加稳定。在B链C端增加2个精氨酸，使等电点从5.4提高到6.7，使甘精胰岛素在弱酸环境下为透明溶液，在生理环境下溶解度大大降低出现沉淀。在配方中加入少量的锌，在皮下注射时使其能在皮下形成结晶，从而延缓吸收时间，从而起到长效降血糖的作用。
[0004]甘精胰岛素的制备一般采用基因工程技术制备前体，原研公司赛诺菲(US 5663291)采用大肠杆菌进行重组发酵制备，其次有采用毕赤酵母发酵表达(Biocon百奥康，IN2008CHE000310)。甘精胰岛素前体转变为甘精胰岛素的经典制备工艺均采用转肽工艺，比如赛诺菲(US 2009/0192073 A1)先制备甘精胰岛素前体B-Arg(B31)Arg(B32)-A-Gly(A21)，通过胰蛋白酶切获得甘精胰岛素与甘精胰岛素类似物B-Arg(B31)-A-Gly(A21)，甘精胰岛素类似物在转肽与脱保护后转换为甘精胰岛素。这种方法制备获得甘精胰岛素的工序复杂，收率较低，导致生产成本极高。
[0005]因此，本领域迫切需要开发工艺简单、环境友好、收率高的甘精胰岛素的制备及纯化方法。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的在于提供一种甘精胰岛素衍生物及其应用。
[0007]在本专利技术的第一方面，提供了一种重组甘精胰岛素融合蛋白，具有式I所示的结构：
[0008]A-FP-TEV-R-G
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(I)
[0009]式中，
[0010]“-”
代表肽键；
[0011]A为无或前导肽，
[0012]FP为绿色荧光蛋白折叠单元，
[0013]TEV为酶切位点，较佳地为TEV酶酶切位点；
[0014]R为用于酶切的精氨酸或赖氨酸；
[0015]G为甘精胰岛素或其活性片段；
[0016]其中，所述的绿色荧光蛋白折叠单元包含2-6个，较佳地2-3个选自下组的β-折叠
单元：
[0017]β-折叠单元氨基酸序列u1VPILVELDGDVNG(SEQ ID NO:11)u2HKFSVRGEGEGDAT(SEQ ID NO:12)u3KLTLKFICTT(SEQ ID NO:13)u4YVQERTISFKD(SEQ ID NO:14)u5TYKTRAEVKFEGD(SEQ ID NO:15)u6TLVNRIELKGIDF(SEQ ID NO:16)u7HNVYITADKQ(SEQ ID NO:17)u8GIKANFKIRHNVED(SEQ ID NO:18)u9VQLADHYQQNTPIG(SEQ ID NO:19)u10HYLSTQSVLSKD(SEQ ID NO:20)u11HMVLLEFVTAAGI(SEQ ID NO:21)。
[0018]在另一优选例中，其特征在于，所述的绿色荧光蛋白折叠单元为u2-u3、u4-u5、u1-u2-u3、u3-u4-u5或u4-u5-u6。
[0019]在另一优选例中，其特征在于，所述的G为Boc修饰的甘精胰岛素前体，具有式II所示的结构:
[0020]GB-X-GA
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(II)
[0021]式中，
[0022]GB为Boc修饰的甘精胰岛素B链，氨基酸序列如SEQ ID NO:5的第1-32位所示，
[0023]X为无或连接肽，较佳地，连接肽的氨基酸序列为R，或如SEQ ID NO:6-9所示(GSKR，AAKR，YPGDVKR或EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALE GSLQKR)；
[0024]GA为甘精胰岛素A链，氨基酸序列如SEQ ID NO:5的第33-53位所示。
[0025]在另一优选例中，所述的R用于胰蛋白酶酶切。
[0026]在另一优选例中，G为序列如SEQ ID NO:5所示的Boc修饰的甘精胰岛素。
[0027]在另一优选例中，GB-X-GA之间存在链内二硫键。
[0028]在另一优选例中，X为无。
[0029]在另一优选例中，所述的重组甘精胰岛素融合蛋白的序列如SEQ ID NO:1所述。
[0030]在另一优选例中，所述甘精胰岛素B链第7位与A链第7位(A7-B7)、B链第19位与A链第20位(A20-B19)之间形成链间二硫键。
[0031]在另一优选例中，所述甘精胰岛素A链第6位与A链第11位(A6-A11)之间形成链内二硫键。
[0032]在本专利技术的第二方面，提供了双链甘精胰岛素融合蛋白，具有式III所示的结构：
[0033]A-FP-TEV-R-D
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(III)
[0034]式中，
[0035]“-”
代表肽键；
[0036]A为无或前导肽，较佳地为序列如SEQ ID NO:2所示的前导肽，
[0037]FP为绿色荧光蛋白折叠单元，
[0038]TEV为酶切位点，较佳地为TEV酶酶切位点(序列为ENLYFQG，SEQ ID NO:4)；
[0039]R为用于酶切的精氨酸或赖氨酸；
[0040]D为Boc修饰的双链甘精胰岛素，所述主链具有下式IV的结构；
[0041][0042]式中，
[0043]“||”代表二硫键；
[0044]GA为甘精胰岛素A链，氨基酸序列如SEQ ID NO:5的第33-53位所示，
[0045]X为无或为连接肽；
[0046]GB为第29位为Boc修饰的甘精胰岛素B链，氨基酸序列如SEQ ID NO:5的第1-32位所示；
[0047]其中，所述的绿色荧光蛋白折叠单元包含2-6个，较佳地2-3个选自下组的β-折叠单元：
[0048]β-折叠单元氨基酸序列u1VPILVELDGDVNG(SEQ ID NO:11)u2HKFSVRGEGEGDAT(SEQ ID NO:12)u3KLTLKFICTT(SEQ ID NO:13)u4YVQERTISFKD(SEQ ID NO:14)u5TYKTRAEVKFEGD(SEQ ID NO:15)u6TLVNRIELKGIDF(SEQ ID NO:16)u7HNVYITADKQ(SEQ ID NO:17)u8GIKANFKIRHNVED(SEQ ID NO:18)u9VQLADHYQQNTPIG本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种重组甘精胰岛素融合蛋白，其特征在于，具有式I所示的结构：A-FP-TEV-R-G
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(I)式中，
“-”
代表肽键；A为无或前导肽，FP为绿色荧光蛋白折叠单元，TEV为酶切位点，较佳地为TEV酶酶切位点；R为用于酶切的精氨酸或赖氨酸；G为甘精胰岛素或其活性片段；其中，所述的绿色荧光蛋白折叠单元包含2-6个选自下组的β-折叠单元：β-折叠单元氨基酸序列u1VPILVELDGDVNG(SEQ ID NO:11)u2HKFSVRGEGEGDAT(SEQ ID NO:12)u3KLTLKFICTT(SEQ ID NO:13)u4YVQERTISFKD(SEQ ID NO:14)u5TYKTRAEVKFEGD(SEQ ID NO:15)u6TLVNRIELKGIDF(SEQ ID NO:16)u7HNVYITADKQ(SEQ ID NO:17)u8GIKANFKIRHNVED(SEQ ID NO:18)u9VQLADHYQQNTPIG(SEQ ID NO:19)u10HYLSTQSVLSKD(SEQ ID NO:20)u11HMVLLEFVTAAGI(SEQ ID NO:21)。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的绿色荧光蛋白折叠单元为u2-u3、u4-u5、u1-u2-u3、u3-u4-u5或u4-u5-u6。3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的G为Boc修饰的甘精胰岛素前体，具有式II所示的结构：GB-X-GA
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(II)式中，GB为第29位为Boc修饰的甘精胰岛素B链，氨基酸序列如SEQ ID NO:5的第1-32位所示，X为无或连接肽；GA为甘精胰岛素A链，氨基酸序列如SEQ ID NO:5的第33-53位所示。4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的重组甘精胰岛素融合蛋白的序列如SEQ ID NO:1所述。5.一种双链甘精胰岛素融合蛋白，其特征在于，具有式III所示的结构：A-FP-TEV-R-D
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(II...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈卫，刘慧玲，骆莉，
申请(专利权)人：宁波鲲鹏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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