高效引入赖氨酸衍生物的氨酰基-tRNA合成酶及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种高效引入赖氨酸衍生物的突变型氨酰基

【技术实现步骤摘要】
高效引入赖氨酸衍生物的氨酰基
‑
tRNA合成酶及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地涉及高效引入赖氨酸衍生物的氨酰基
‑
tRNA合成酶。

技术介绍

[0002]氨酰基
‑
tRNA合成酶(aaRS)是参与蛋白质合成的酶。具体而言，可使氨基酸与tRNA形成酯键从而具有合成氨酰基tRNA的活性。氨酰基
‑
tRNA是一种分子，参与在核糖体构成蛋白质的肽链的伸长。使用某些氨酰基tRNA合成酶可将非天然氨基酸引入蛋白质中，目前使用源自各种生物种类的氨基酰
‑
tRNA合成酶(aaRS)/tRNA对，已经合成了30种类以上的全蛋白质。历史最长并且应用于许多有用非天然氨基酸导入的体系为酪氨酰
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tRNA合成酶(TyrRS)突变体与经琥珀抑制基因化tRNA
Tyr
对。就该方法而言，成为关键的是其正交的关系，即，真细菌、与古细菌和真核生物这两个组中的aaRS在各自的组内将tRNA氨基酰化，但不能将其它组的tRNA氨基酰化。
[0003]另一方面，来自噬甲基念珠菌(Candidatus Methanomethylophilus alvus Mx1201)的吡咯赖氨酰
‑
tRNA合成酶(CmaPylS)和琥珀抑制基因tRNAPyl，在大肠杆菌细胞内作为具有正交性的CmaPylS/CmaPylT对而发挥功能。
[0004]通常，为了将赖氨酸衍生物导入蛋白质，存在改变赖氨酰
‑
tRNA合成酶(LysRS)的底物特异性的方法。但是，由于LysRS对赖氨酸的识别严密，因此，至今为止，很难将具有各种大小、形状的官能团的赖氨酸衍生物位点特异性地导入蛋白质。吡咯赖氨酸(Pyrrolysine)是在侧链上具有大体积甲基吡咯啉部分的赖氨酸衍生物。野生型PylRS虽能够活化其赖氨酸衍生物，但是其能够活化的赖氨酸衍生物的活力有限。
[0005]本专利技术致力于通过改造野生型PylRS，增强其对于赖氨酸衍生物的活性，高效地将赖氨酸衍生物位点特异性的整合在希望的蛋白质中。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种高效引入赖氨酸衍生物的氨酰基
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tRNA合成酶。
[0007]在本专利技术的第一方面，提供了一种突变的氨酰基
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tRNA合成酶，所述突变的氨酰基
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tRNA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
[0008]在另一优选例中，所述突变的氨酰基
‑
tRNA合成酶是在野生型氨酰基
‑
tRNA合成酶的基础上进行突变获得的。
[0009]在另一优选例中，所述野生型氨酰基
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tRNA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
[0010]在另一优选例中，所述的野生型氨酰基
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tRNA合成酶来源于嗜甲烷假丝酵母Candidatus Methanomethylophilus alvus。
[0011]在另一优选例中，所述突变的氨酰基
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tRNA合成酶的活性是野生型氨酰基
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tRNA合成酶的至少1.2倍，优选地至少1.4倍，优选地至少1.6，更优选地至少2倍。
[0012]在另一优选例中，所述的氨酰基
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tRNA合成酶具有将非天然氨基酸结合于tRNA的活性的蛋白质。
[0013]在另一优选例中，所述的非天然氨基酸为赖氨酸衍生物，赖氨酸类似物。
[0014]在另一优选例中，所述的赖氨酸衍生物包括：
[0015]·
包含芳族侧链；
[0016]·
包含叠氮基；
[0017]·
包含炔烃基团；或者
[0018]·
包含醛或酮基团的脂肪酰化赖氨酸。
[0019]在另一优选例中，所述的非天然氨基酸为Boc修饰的赖氨酸。
[0020]在另一优选例中，所述的非天然氨基酸为丁炔氧羰基修饰的赖氨酸。
[0021]在另一优选例中，利用突变的氨酰基
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tRNA合成酶进行非天然氨基酸修饰的融合蛋白的表达所得到的融合蛋白表达量与断链蛋白表达量比值V1，与利用野生型氨酰基
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tRNA合成酶进行非天然氨基酸修饰的融合蛋白的表达所得到的融合蛋白表达量与断链蛋白表达量比值V2相比，V1/V2优选地不低于1.2，优选地不低于1.4，优选地不低于1.6，更优选地不低于2.0。
[0022]在另一优选例中，所述的断链蛋白是在融合蛋白表达过程中产生的不含非天然氨基酸的非目的蛋白。
[0023]在另一优选例中，利用突变的氨酰基
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tRNA合成酶进行非天然氨基酸修饰的融合蛋白的表达所得到的融合蛋白表达量L1，与利用野生型氨酰基
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tRNA合成酶进行非天然氨基酸修饰的融合蛋白的表达所得到的融合蛋白表达量L2相比，L1/L2大于1.1，优选地大于1.2。
[0024]在本专利技术的第二方面，提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码本专利技术第一方面所述的突变的氨酰基
‑
tRNA合成酶。
[0025]在本专利技术的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本专利技术第二方面所述的多核苷酸分子。
[0026]在本专利技术的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本专利技术第三方面所述的载体或染色体整合有本专利技术第二方面所述的多核苷酸分子。
[0027]在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞、真核细胞或哺乳细胞。
[0028]在另一优选例中，所述原核细胞为大肠杆菌。
[0029]在另一优选例中，所述宿主细胞还含有用于表达融合蛋白的载体或染色体中整合有融合蛋白表达盒，其中，所述的融合蛋白中含有赖氨酸衍生物。
[0030]在另一优选例中，所述宿主细胞还含有叔丁氧羰基(Boc)修饰的融合蛋白的表达载体。
[0031]在另一优选例中，所述宿主细胞还含有丁炔氧羰基修饰的融合蛋白的表达载体。
[0032]在另一优选例中，所述的目的蛋白为人胰岛素、门冬胰岛素、德谷胰岛素前体、赖脯胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素前体、甲状旁腺素、可的瑞琳、降血钙素、比伐卢定、胰高血糖素样肽及其衍生物、艾塞那肽、利拉鲁肽前体、索马鲁肽前体、阿必鲁肽前体、度拉鲁肽前体、甲状旁腺激素、齐考诺肽、舍莫瑞林、生长瑞林、分泌素、替度鲁肽、水蛭素、生长激素、生长因子、生长激素释放因子、促肾上腺皮质激素、释放因子、德舍瑞林、去氨加压素、依降
钙素、胰高血糖素、亮丙瑞林、促黄体激素释放激素、生长激素抑制素、促甲状腺激素释放激素、曲普瑞林、血管活性肠肽、干扰素、BH3肽、淀粉样变肽，或上述肽的片段，或其组合。
[0033]在本专利技术的第五方面，提供了一种制备的融合蛋白的方法，包括步骤：...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种突变的氨酰基
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tRNA合成酶，其特征在于，所述突变的氨酰基
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tRNA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。2.一种多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子编码权利要求1所述的突变的氨酰基
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tRNA合成酶。3.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求2所述的多核苷酸分子。4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的载体或染色体整合有权利要求2所述的多核苷酸分子。5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。6.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞还含有用于表达融合蛋白的载体或染色体中整合有融合...

【专利技术属性】
技术研发人员：于歌，陈卫，吴松，
申请(专利权)人：宁波鲲鹏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：