融合多肽制造技术

本文尤其提供了包含用于表达和纯化一种或多种目的多肽的改进的蛋白酶识别序列的融合DNA构建体，以及用于在重组宿主细胞中生产一种或多种目的多肽的方法。一种或多种目的多肽的方法。一种或多种目的多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】融合多肽
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年3月8日提交的美国临时专利申请号62/815,912的优先权，所述申请的公开通过引用以其全文并入本文。


[0003]本文尤其提供包含改进的可裂解融合多肽的组合物以及利用其在宿主细胞中产生一种或多种目的多肽的方法。

技术介绍

[0004]已经报道了在包括大肠杆菌(E.coli)、酵母和丝状真菌的多种生物体中产生融合多肽。在这些融合蛋白中的一些融合蛋白中，在目的多肽和运载体蛋白之间已经插入了蛋白酶识别位点(例如，Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术](纽约),9(4):378
‑
81和Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术](纽约),13(5):498
‑
503)。然而，在许多情况下已经观察到不完全裂解，其导致一种或多种目的多肽的产量欠佳。因此，需要用于改进的融合蛋白生产的组合物和方法以及高效且完全的蛋白酶介导的融合蛋白裂解。本文公开的主题满足了这些需求并且还提供了额外的益处。

技术实现思路

[0005]本文尤其提供了具有改变的氨基酸序列的非天然存在的工程化的融合多肽以及利用所述融合多肽的方法，当在宿主细胞中生产和纯化一种或多种目的多肽时，所述改变的氨基酸序列导致改进的或完全的蛋白酶介导的(诸如，KEX2介导的)裂解。与不含有所公开的改变的氨基酸序列的融合多肽和/或未根据本文公开的方法使用融合多肽相比，所公开的方法、工程化的融合多肽、和重组宿主细胞提供增强的一种或多种目的多肽的融合多肽的分泌和/或纯化。
[0006]因此，在一些方面，本文提供了包含氨基酸序列T1‑
S2‑
V
‑
A3‑
V4‑
E5‑
X1‑
X2‑
Q6‑
V7‑
(SEQ ID NO:1)的融合多肽，其中：1)X1和X2是碱性氨基酸；并且2)所述氨基酸序列具有选自由以下组成的组的一个或多个取代：T1被选自由疏水性氨基酸、芳香族氨基酸、酸性氨基酸、和碱性氨基酸组成的组的氨基酸取代；S2被选自由疏水性氨基酸、芳香族氨基酸、碱性氨基酸、和影响链取向的氨基酸组成的组的氨基酸取代；A3被选自由碱性氨基酸和M组成的组的氨基酸取代；V4被L取代；E5被芳香族氨基酸取代；Q6被选自由酸性氨基酸和影响链取向的氨基酸组成的组的氨基酸取代；和/或V7被选自由L、I、和芳香族氨基酸组成的组的氨基酸取代。在一些实施例中，T1被选自由A、F、M、Q、R、N、E、和Y组成的组的氨基酸取代；S2被选自由F、H、K、L、M、P、Q、R、N、和V组成的组的氨基酸取代；A3被选自由H、K、M、和R组成的组的氨基酸取代；E5被选自由F和W组成的组的氨基酸取代；Q6被选自由D和G组成的组的氨基酸取代；和/或V7被选自由L、I、和F组成的组的氨基酸取代。
[0007]在本文公开的任一实施例的一些实施例中，所述氨基酸序列选自由以下组成的
ID NO:61)、和RKVAVEKRDLTL(SEQ ID NO:62)。在本文公开的任一实施例的一些实施例中，所述融合多肽包含五个或更多个取代。在一些实施例中，所述氨基酸序列是RKVRVEKRDLTL(SEQ ID NO:63)。在本文公开的任一实施例的一些实施例中，X1和X2选自由KK、RR、KR、和RK组成的组。在本文公开的任一实施例的一些实施例中，所述氨基酸序列被一种或多种蛋白酶完全裂解。在一些实施例中，所述蛋白酶是Kex2丝氨酸肽酶(EC 3.4.21.61)。在本文公开的任一实施例的一些实施例中，所述融合多肽进一步地包含编码信号序列的多肽。在一些实施例中，编码信号序列的多肽位于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N
‑
末端或C
‑
末端。在本文公开的任一实施例的一些实施例中，所述融合多肽进一步地包含编码运载体蛋白的多肽。在一些实施例中，编码运载体蛋白的多肽位于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N
‑
末端或C
‑
末端。在本文公开的任一实施例的一些实施例中，所述编码运载体蛋白的多肽邻接所述编码信号序列的多肽。在本文公开的任一实施例的一些实施例中，所述运载体蛋白包含CBH1或其片段。在本文公开的任一实施例的一些实施例中，所述融合多肽进一步地包含目的多肽。在一些实施例中，编码目的多肽的多肽位于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N
‑
末端或C
‑
末端。在本文公开的任一实施例的一些实施例中，所述目的多肽是酶。在一些实施例中，所述酶是选自由以下组成的组的酶：活性或非活性碳水化合物降解酶、蛋白酶、脂肪酶、和细胞裂解酶。在本文公开的任一实施例的一些实施例中，所述目的多肽是治疗性蛋白。在一些实施例中，所述治疗性蛋白是抗体或其功能性片段。在一些实施例中，所述抗体是轻链或重链单克隆抗体。在本文公开的任一实施例的一些实施例中，所述信号序列是CBH1信号序列，所述运载体蛋白是含有CBH1的运载体蛋白，并且所述目的多肽是抗体轻链或其功能性片段。在本文公开的任一实施例的一些实施例中，所述信号序列是CBH1信号序列，所述运载体蛋白是含有CBH1的运载体蛋白，并且所述目的多肽是抗体重链或其功能性片段。在本文公开的任一实施例的一些实施例中，所述信号序列是CBH1信号序列，所述运载体蛋白是含有CBH1的运载体蛋白，并且所述目的多肽是抗体重链或其片段和抗体轻链或其功能性片段。在一些实施例中，所述抗体或其功能性片段是单域抗体(sdAb)。在一些实施例中，所述抗体或其功能性片段选自由以下组成的组：Fv、Fab、Fab'、Fab'
‑
SH、F(ab')2、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)、和由抗体片段形成的多特异性抗体。在本文公开的任一实施例的一些实施例中，所述抗体或其功能性片段是抗呼吸道合胞病毒(RSV)抗体、抗埃博拉病毒抗体、抗聚集β
‑
淀粉样蛋白(Aβ)抗体、抗人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体、抗单纯疱疹病毒(HSV)抗体、抗精子抗体(诸如抗人避孕抗原(HCA)抗体)、和抗HER2/neu抗体。
[0008]在其他方面，本文提供了编码本文公开的任一融合多肽的核酸。
[0009]在进一步的方面，本文提供了编码本文公开的任一核酸的载体。在一些实施例中，所述载体进一步地包含编码启动子的核酸序列。
[0010]在又其他方面，本文提供包含本文公开的任一融合多肽、本文公开的任一核酸、和/或本文公开的任一载体的宿主细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞选自由哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、和真菌宿主细胞组成的组。在一些实施例中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施例中，所述细菌细胞是大肠杆菌细胞。在一些实施例中，所述真菌细胞是酵母细胞或丝状真菌细胞。在一些实施例中，所述酵母细胞是酵母菌属(Saccharomyces)物种。在本文公开的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含氨基酸序列T1‑
S2‑
V
‑
A3‑
V4‑
E5‑
X1‑
X2‑
Q6‑
V7‑
(SEQ ID NO:1)的融合多肽，其中：1)X1和X2是碱性氨基酸；并且2)所述氨基酸序列具有选自由以下组成的组的一个或多个取代：a.T1被选自由疏水性氨基酸、芳香族氨基酸、酸性氨基酸、和碱性氨基酸组成的组的氨基酸取代；b.S2被选自由疏水性氨基酸、芳香族氨基酸、碱性氨基酸、和影响链取向的氨基酸组成的组的氨基酸取代；c.A3被选自由碱性氨基酸和M组成的组的氨基酸取代；d.V4被L取代；e.E5被芳香族氨基酸取代；f.Q6被选自由酸性氨基酸和影响链取向的氨基酸组成的组的氨基酸取代；和/或g.V7被选自由L、I、和芳香族氨基酸组成的组的氨基酸取代。2.如权利要求1所述的融合多肽，其中a.T1被选自由A、F、M、Q、R、N、E、和Y组成的组的氨基酸取代；b.S2被选自由F、H、K、L、M、P、Q、R、N、和V组成的组的氨基酸取代；c.A3被选自由H、K、M、和R组成的组的氨基酸取代；d.E5被选自由F和W组成的组的氨基酸取代；和/或e.Q6被选自由D和G组成的组的氨基酸取代f.V7被选自由L、I、和F组成的组的氨基酸取代。3.如权利要求1或权利要求2所述的融合多肽，所述融合多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：ASVAVEKRQV(SEQ ID NO:3)、FSVAVEKRQV(SEQ ID NO:2)、MSVAVEKRQV(SEQ ID NO:4)、QSVAVEKRQV(SEQ ID NO:5)、RSVAVEKRQV(SEQ ID NO:6)、和YSVAVEKRQV(SEQ ID NO:7)。4.如权利要求1或权利要求2所述的融合多肽，所述融合多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：TFVAVEKRQV(SEQ ID NO:8)、THVAVEKRQV(SEQ ID NO:9)、TKVAVEKRQV(SEQ ID NO:10)、TLVAVEKRQV(SEQ ID NO:11)、TMVAVEKRQV(SEQ ID NO:12)、TPVAVEKRQV(SEQ ID NO:13)、TQVAVEKRQV(SEQ ID NO:14)、TRVAVEKRQV(SEQ ID NO:15)、和TVVAVEKRQV(SEQ ID NO:16)。5.如权利要求1或权利要求2所述的融合多肽，所述融合多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：TSVHVEKRQV(SEQ ID NO:17)、TSVKVEKRQV(SEQ ID NO:18)、和TSVRVEKRQV(SEQ ID NO:19)。6.如权利要求1或权利要求2所述的融合多肽，所述融合多肽包含氨基酸序列TSVALEKRQV(SEQ ID NO:20)。7.如权利要求1或权利要求2所述的融合多肽，所述融合多肽包含选自由TSVAVFKRQV(SEQ ID NO:21)和TSVAVWKRQV(SEQ ID NO:22)组成的组的氨基酸序列。8.如权利要求1或权利要求2所述的融合多肽，所述融合多肽包含选自由TSVAVEKRDV(SEQ ID NO:23)和TSVAVEKRGV(SEQ ID NO:24)组成的组的氨基酸序列。9.如权利要求1或权利要求2所述的融合多肽，所述融合多肽包含选自由TSVAVEKRQF(SEQ ID NO:25)和TSVAVEKRQL(SEQ ID NO:26)组成的组的氨基酸序列。
ID NO:55)、EHVALWKRQVTL(SEQ ID NO:56)、EPVALWKRQVTL(SEQ ID NO:57)、NHVALWKRQVTL(SEQ ID NO:58)、RSVRVEKRDLTL(SEQ ID NO:59)、RKVRVEKRDVTL(SEQ ID NO:60)、RKVRVEKRQLTL(SEQ ID NO:61)、和RKVAVEKRDLTL(SEQ ID NO:62)。27.如权利要求1
‑
2或10
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11中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽包含五个或更多个取代。28.如权利要求27所述的融合多肽，所述融合多肽包含氨基酸序列RKVRVEKRDLTL(SEQ ID NO:63)。29.如权利要求1
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2或10
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11中任一项所述的融合多肽，其中X1和X2选自由KK、RR、KR、和RK组成的组。30.如权利要求1
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29中任一项所述的融合多肽，其中所述氨基酸序列被一种或多种蛋白酶完全裂解。31.如权利要求30所述的融合多肽，其中所述蛋白酶是Kex2丝氨酸肽酶(EC 3.4.21.61)。32.如权利要求1
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31中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽进一步地包含编码信号序列的多肽。33.如权利要求32所述的融合多肽，其中所述编码信号序列的多肽位于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N
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末端或C
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末端。34.如权利要求1
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33中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽进一步地包含编码运载体蛋白的多肽。35.如权利要求34所述的融合多肽，其中所述编码运载体蛋白的多肽位于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N
‑
末端或C
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末端。36.如权利要求34或权利要求35所述的融合多肽，其中所述编码运载体蛋白的多肽邻接所述编码信号序列的多肽。37.如权利要求34
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36中任一项所述的融合多肽，其中所述运载体蛋白包含CBH1或其片段。38.如权利要求1
‑
37中任一项所述的融合多肽，所述融合多肽进一步地包含目的多肽。39.如权利要求38所述的融合多肽，其中编码目的多肽的所述多肽位于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N
‑
末端或C
‑
末端。40.如权利要求38或权利要求39所述的融合多肽，其中所述目的多肽是酶。41.如权利要求40所述的融合多肽，其中所述酶是选自由以下组成的组的酶：活性或非活性碳水化合物降解酶、蛋白酶、脂肪酶、和细胞裂解酶。42.如权利要求38或权利要求39所述的融合多肽，其中所述目的多肽是治疗性蛋白。43.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：发明
国别省市：