【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种重组酵母细胞和一种用于生产乙醇的方法，其中使用所述重组酵母细胞。
技术介绍
1、微生物发酵方法适用于从可再生碳水化合物原料工业生产广泛且快速扩大范围的化学化合物。尤其是在厌氧发酵方法中，辅因子对nadh/nad+的氧化还原平衡可能对产物产率造成重大限制。这种挑战的示例为在由酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)工业生产例如燃料乙醇时作为主要副产物的甘油的形成，这是需要再氧化在生物合成反应中形成的nadh的直接结果。
2、按体积计，由酿酒酵母生产乙醇是目前工业生物技术中最大的单一发酵方法。已经提出了多种方法以通过基因修饰来改善工业生物技术中使用的生物体的发酵性质。与基于酵母的乙醇生产的化学计量相关的重大挑战是大量的nadh依赖性副产物(诸如甘油)通常作为副产物形成，尤其是在厌氧和氧气受限的条件下或在呼吸以其他方式受限或不存在的条件下。据估计，在典型的工业乙醇工艺中，高达约4wt.％的糖原料被转化为甘油(nissen t,2000)。在对于厌氧生长理想的条件下，向甘油的转化甚至可能更高，高达约10％。
3、厌氧条件下的甘油生产主要与氧化还原代谢有关。在酿酒酵母(s.cerevisiae)的厌氧生长过程中，经由酒精发酵发生糖异化。在该过程中，在糖酵解甘油醛-3-磷酸脱氢酶反应中形成的nadh通过经由nad+依赖性醇脱氢酶将由丙酮酸脱羧形成的乙醛转化为乙醇而被再氧化。当nad+向nadh的净还原发生在代谢的其他地方时，这种氧化还原-中性异化途径的固定化学计量会引起问题。在厌
4、然而，在文献中，已经报道了几种不同的方法，这些方法可以帮助减少甘油的副产物形成并且使碳转向至乙醇，使得每克发酵碳水化合物的乙醇产率增加。
5、wo 2015/148272描述了表达异源磷酸转酮酶、磷酸转乙酰酶和乙酰化乙醛脱氢酶的重组酿酒酵母菌株。还描述了通过减少甘油生物合成途径(在缺失了gpd1的实施例中示出)，可以实现更高的产率。然而，诸位专利技术人提到，对于甘油合成途径减少的菌株，葡萄糖发酵速率较慢。
6、此外，如wo 2018/172328中所解释的，在工业环境中，以上菌株的耐高渗性和对外部环境的应激反应可能受到影响。
7、因此，需要继续改善。例如，提供在高干物质条件和/或高温下具有改善的稳健性和/或在酵母细胞内具有减少的葡萄糖积累和/或总糖含量的酵母细胞和方法将是本领域的进步。也就是说，即使在发酵开始和/或整个发酵过程中存在高浓度的葡萄糖的情况下，在发酵结束时实现酵母细胞的持续性能和/或低浓度的剩余葡萄糖将是本领域的进步。
技术实现思路
1、诸位专利技术人现在已经出人意料地发现，通过用特定启动子促进转酮酶甚至可以进一步改善wo 2014/081803和wo 2015/148272的方法和酵母细胞。
2、因此，本专利技术提供了一种重组酵母细胞，该重组酵母细胞功能性地表达：
3、a)编码包含磷酸转酮酶(pkl)活性的蛋白质(ec 4.1.2.9或ec4.1.2.22)的核酸序列和/或编码具有磷酸转乙酰酶(pta)活性的蛋白质(ec 2.3.1.8)的核酸序列和/或编码具有乙酸激酶(ack)活性的蛋白质(ec 2.7.2.12)的核酸序列；以及
4、b)编码具有转酮酶活性的蛋白质(ec 2.2.1.1)的核酸序列，
5、其中编码具有转酮酶活性的该蛋白质的该核酸序列的表达在启动子(“tkl启动子”)的控制下，该tkl启动子对转酮酶的厌氧/好氧表达比率为2或更高。
6、此外，本专利技术提供了一种用于生产乙醇的方法，该方法包括使用以上重组酵母细胞转化碳源(诸如碳水化合物或另一种有机碳源)，从而适当地形成乙醇。
7、有利地，使用以上重组酵母细胞和/或以上方法使得稳健性得到改善。当应用具有高干固体含量的培养基时和/或如果应用高发酵温度，这是尤其有利的。
8、从碳源(诸如碳水化合物)生产乙醇的方法可以有利地在存在糖解酶(诸如葡糖淀粉酶)的情况下进行，以将多糖和/或寡糖转化为葡萄糖。当该方法在具有高干物质含量的培养基中进行时，例如在用高浓度玉米醪开始该方法后，培养基中葡萄糖的浓度可能变得非常高。不希望受任何类型的理论的约束，据信高浓度的葡萄糖可能引起酵母细胞的渗透应激，导致酵母细胞停止表现出性能，甚至死亡。
9、不希望受任何类型的理论的约束，据信与不包含tkl启动子的酵母细胞相比，以上重组酵母细胞允许葡萄糖和/或其他糖在酵母细胞内的积累减少，从而适当地允许改善稳健性。
10、通过实例说明优点。在实例中，发酵在36％w/w的高干物质含量下进行。如实例所展示，根据本专利技术的重组酵母细胞以及根据本专利技术的方法允许酵母细胞的持续性能和/或葡萄糖的持续转化。即使在包含浓度高达36％w/w的葡萄糖的培养基中和/或高达32℃的温度下，重组酵母细胞在66小时后仍将碳水化合物转化为乙醇。因此，即使在发酵开始和/或整个发酵过程中存在高浓度的葡萄糖的情况下，在发酵结束时仍可以获得低浓度的剩余葡萄糖。
11、序列表说明
12、本申请含有呈计算机可读形式的序列表，将其通过援引并入本文。下表1提供了概述。
13、表1：序列表的概述：
14、
15、
16、
17、
18、
19、在本专利申请的上下文中，每个以上蛋白质/氨基酸序列都优选地由针对在酵母中表达、更优选地针对在酿酒酵母中表达进行密码子对优化的dna/核酸序列编码。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种重组酵母细胞，所述重组酵母细胞功能性地表达：
2.根据权利要求1所述的重组酵母细胞，其中所述TKL启动子是选自由以下组成的列表的基因的启动子：FET4、ANB1、YHR048W、DAN1、AAC3、TIR2、DIP5、HEM13、YNR014W、YAR028W、FUN 57、COX5B、OYE2、SUR2、FRDS1、PIS1、LAC1、YGR035C、YAL028W、EUG1、HEM14、ISU2、ERG26、YMR252C、SML1、TIR2、TIR4、TIR3、PAU7、PAU5、YLL064C、YGR294W、DAN3、YIL176C、YGL261C、YOL161C、PAU1、PAU6、DAN2、YDR542W、YIR041W、YKL224C、PAU3、YLL025W、YOR394W、YHL046C、YMR325W、YAL068C、YPL282C、PAU2、PAU4。
3.根据权利要求1或2所述的重组酵母菌株，其中所述TKL启动子是合成的寡核苷酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组酵母细胞，其中编码具有转酮酶活性的蛋白质
5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组酵母细胞，其中所述重组酵母细胞功能性地表达编码具有转酮酶活性的蛋白质的异源核酸序列。
6.根据权利要求5所述的重组酵母细胞，其中具有转酮酶活性的所述蛋白质包含以下或由以下组成：
7.根据权利要求5或6所述的重组酵母细胞，其中编码具有转酮酶活性的所述蛋白质的所述异源核酸序列在所述TKL启动子的控制下。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的重组酵母细胞，其中所述重组酵母细胞是重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酵母细胞，其功能性地表达编码具有转酮酶活性的蛋白质的异源核酸序列，其中：
9.根据权利要求5至8中任一项所述的重组酵母细胞，其中编码具有转酮酶活性的蛋白质的天然核酸序列已经被破坏或缺失。
10.根据权利要求5至8中任一项所述的重组酵母细胞，其中除了编码具有转酮酶活性的蛋白质的天然核酸序列之外，所述重组酵母细胞还包含编码具有转酮酶活性的所述蛋白质的所述异源核酸序列。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的重组酵母细胞，其中包含磷酸转酮酶(PKL)活性的所述蛋白质包含以下或由以下组成：
12.根据权利要求1至11中任一项所述的重组酵母细胞，其中具有磷酸转乙酰酶(PTA)活性的所述蛋白质包含以下或由以下组成：
13.根据权利要求1至12中任一项所述的重组酵母细胞，其中所述重组酵母细胞进一步功能性地表达：
14.根据权利要求1至13中任一项所述的重组酵母细胞，其中所述重组酵母细胞进一步功能性地表达编码具有葡糖淀粉酶活性的蛋白质(EC 3.2.1.20或3.2.1.3)的核酸序列。
15.一种用于生产乙醇的方法，所述方法包括使用根据权利要求1至14中任一项所述的重组酵母细胞转化碳源，优选碳水化合物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法至少部分地在包含以下葡萄糖浓度的葡萄糖的培养基中进行：25g/L或更高、30g/L或更高、35g/L或更高、40g/L或更高、45g/L或更高、50g/L或更高、55g/L或更高、60g/L或更高、65g/L或更高、70g/L或更高、75g/L或更高、80g/L或更高、85g/L或更高、90g/L或更高、95g/L或更高、100g/L或更高、110g/L或更高或者120g/L或更高。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述方法至少部分地在存在诸如葡糖淀粉酶的糖解酶的情况下进行。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种重组酵母细胞，所述重组酵母细胞功能性地表达：
2.根据权利要求1所述的重组酵母细胞，其中所述tkl启动子是选自由以下组成的列表的基因的启动子：fet4、anb1、yhr048w、dan1、aac3、tir2、dip5、hem13、ynr014w、yar028w、fun 57、cox5b、oye2、sur2、frds1、pis1、lac1、ygr035c、yal028w、eug1、hem14、isu2、erg26、ymr252c、sml1、tir2、tir4、tir3、pau7、pau5、yll064c、ygr294w、dan3、yil176c、ygl261c、yol161c、pau1、pau6、dan2、ydr542w、yir041w、ykl224c、pau3、yll025w、yor394w、yhl046c、ymr325w、yal068c、ypl282c、pau2、pau4。
3.根据权利要求1或2所述的重组酵母菌株，其中所述tkl启动子是合成的寡核苷酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组酵母细胞，其中编码具有转酮酶活性的蛋白质的天然核酸序列在所述tkl启动子的控制下。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组酵母细胞，其中所述重组酵母细胞功能性地表达编码具有转酮酶活性的蛋白质的异源核酸序列。
6.根据权利要求5所述的重组酵母细胞，其中具有转酮酶活性的所述蛋白质包含以下或由以下组成：
7.根据权利要求5或6所述的重组酵母细胞，其中编码具有转酮酶活性的所述蛋白质的所述异源核酸序列在所述tkl启动子的控制下。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的重组酵母细胞，其中所述重组酵母细胞是重组酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)酵母细胞，其功能性地表达编码具有转酮酶活性的蛋白质...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·L·罗塞尔阿拉贡特，M·L·A·詹森，I·M·武格特范卢茨，J·P·J·施密茨，E·T·范里吉，R·M·德容，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：发明
国别省市：
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