【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及到一种高活性和高浓度底物耐受性的天冬酰胺合成酶a突变体及其应用。
技术介绍
1、天冬酰胺合成酶在各种生物体中都普遍存在，根据对反应的氨供体不同，将天冬酰胺合成酶分为两类：天冬酰胺合成酶a(as-a，ec6.3.1.1)和天冬酰胺合成酶b(as-b，ec6.3.5.4)。其中as-a仅存在于原核生物中，它们只能利用铵根离子作为氨供体；而as-b不仅存在于原核生物中，同时又能存在于真核生物中，as-b的氨供体既可以是铵根离子，也可以是谷氨酰胺。尽管两种酶能催化合成同种物质，但as-a和as-b的序列一致性极低，且as-a蛋白比as-b小。利用as-a催化合成l-天冬酰胺是一种绿色环保，且成本低、副产物少的方法。
2、l-天冬酰胺((l-asparagine，l-asn)，别名2-氨基-3-氨基甲酰丙酸，是生物体内常见的20种氨基酸之一，也是生糖氨基酸家族成员之一，可以通过代谢变为葡萄糖。l-asn在各个领域都有一定的应用。如l-asn会与糖类产生美拉德反应使得食物更具风味，但在特殊的高温环境下，l-asn会与糖类产生反应生成丙烯酰胺。除此之外，它可以与炔诺酮进行聚合形成复合物具有医学上的作用。野生型as-a的比酶活低，并且存在着严重的底物抑制，随着底物asp浓度的升高，as-a的比酶活降低。在张奇等研究中，其筛选的天冬酰胺合成酶可以催化1m的l-天冬氨酸。然而实际实验中，该种天冬酰胺合成酶的底物耐受性无法达到1m的高浓度底物。因此需要改造菌株以期可以被应用到更多的催化反应中发挥其作用。p>
技术实现思路
1、本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。
2、鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本专利技术。
3、因此，本专利技术的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种酶活性提高的天冬酰胺合成酶a突变体。
4、为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种酶活性提高的天冬酰胺合成酶a突变体，其特征在于：所述天冬酰胺合成酶a突变体是将来源于唾液乳杆菌lactobacillus salivarius的天冬酰胺合成酶a氨基酸序列的第53位的赖氨酸突变为丙氨酸、第71位的组氨酸突变为缬氨酸、第100位的精氨酸突变为丙氨酸、第110位的组氨酸突变为谷氨酸、第214位精氨酸突变为谷氨酸、第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其中的一种或组合获得。
5、作为本专利技术所述突变体的一种优选方案，其中：所述天冬酰胺合成酶a的氨基酸序列如seq id no.1所示；
6、所述天冬酰胺合成酶a突变体为下述任意一种：
7、(i)第53位的赖氨酸突变为丙氨酸,其氨基酸序列如seq id no.2所示；
8、(ii)第71位的组氨酸突变为缬氨酸，其氨基酸序列如seq id no.3所示；
9、(iii)第100位的精氨酸突变为丙氨酸，其氨基酸序列如seq id no.4所示；
10、(iv)第110位的组氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如seq id no.5所示；
11、(v)第214位的精氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如seq id no.6所示；
12、(vi)第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如seq id no.7所示；
13、(vii)第71位的组氨酸突变为缬氨酸以及第110位的组氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如seq id no.8所示；
14、(viii)第71位的组氨酸突变为缬氨酸以及第214位的精氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如seq id no.9所示；
15、(ix)第110位的组氨酸突变为谷氨酸以及第214位的精氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如seq id no.10所示；
16、(x)第110位的组氨酸突变为谷氨酸以及第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如seq id no.11所示；
17、(xi)第214位的精氨酸突变为谷氨酸以及第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如seq id no.12所示；
18、(xii)第71位的组氨酸突变为缬氨酸、第110位的组氨酸突变为谷氨酸以及第214位的精氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如seq id no.13所示；
19、(xiii)第71位的组氨酸突变为缬氨酸、第110位的组氨酸突变为谷氨酸以及第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如seq id no.14所示；
20、(xiv)第71位的组氨酸突变为缬氨酸、第214位的精氨酸突变为谷氨酸以及第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如seq id no.15所示；
21、(xv)第110位的组氨酸突变为谷氨酸、第214位的精氨酸突变为谷氨酸以及第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如seq id no.16所示；
22、(xvi)第71位的组氨酸突变为缬氨酸、第110位的组氨酸突变为谷氨酸、第214位的精氨酸突变为谷氨酸以及第218位的酪氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如seq id no.17所示。
23、本专利技术的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供编码所述突变体天冬酰胺合成酶a的基因。
24、本专利技术的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种重组质粒，包括天冬酰胺合成酶a的基因。
25、本专利技术的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种宿主细胞，包括上述重组质粒。
26、作为本专利技术所述宿主细胞的一种优选方案，其中：所述宿主细胞包括大肠杆菌枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸菌、毕赤酵母中的一种。
27、本专利技术的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种表达天冬酰胺合成酶a突变体的重组菌株。
28、作为本专利技术所述突变体的一种优选方案，其中：所述突变体能提高天冬酰胺合成酶a的酶活性以及底物耐受浓度。
29、本专利技术的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种酶活性提高的天冬酰胺合成酶a突变体在生产l-天冬酰胺中的应用。
30、作为本专利技术所述应用的一种优选方案，其中：所述以l-天冬酰胺、氯化铵、atp/葡萄糖为底物，以天冬酰胺合成酶a突变体为催化剂催化转化生产l-天冬酰胺。
31、本专利技术有益效果：
32、1.本专利技术通过半理性设计、定点突变技术和饱和突变改造asa分子结构，最终获得了酶活性提高278.74％的突变体酶h71v/h110e/r214e/y218g。
33、2.在30℃下孵育，asa突变体h71v/h110e/r214e/218g底物耐受浓度为500mm，野生型的底物耐受浓度为100mm，a本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酶活性提高的天冬酰胺合成酶A突变体，其特征在于：所述天冬酰胺合成酶A突变体是将来源于唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius的天冬酰胺合成酶A氨基酸序列的第53位的赖氨酸突变为丙氨酸、第71位的组氨酸突变为缬氨酸、第100位的精氨酸突变为丙氨酸、第110位的组氨酸突变为谷氨酸、第214氨酸突变为谷氨酸、第218位的酪氨酸突变为甘氨酸其中的一种或组合获得。
2.如权利要求1所述的天冬酰胺合成酶A突变体，其特征在于：所述天冬酰胺合成酶A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
3.编码权利要求1所述突变体天冬酰胺合成酶A的基因。
4.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒包含权利要求3所述的基因。
5.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有权利要求4所述的重组质粒。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包括大肠杆菌枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸菌、毕赤酵母中的一种。
7.一种表达权利要求1所述天冬酰胺合成酶A突变体的重组菌株。
8.如权利要求1所述
9.如权利要求1所述的天冬酰胺合成酶A突变体在生产L-天冬酰胺中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述以天冬酰胺、氯化铵以及ATP/葡萄糖为底物，以天冬酰胺合成酶A突变体为催化剂催化生产L-天冬酰胺。
...【技术特征摘要】
1.一种酶活性提高的天冬酰胺合成酶a突变体，其特征在于：所述天冬酰胺合成酶a突变体是将来源于唾液乳杆菌lactobacillus salivarius的天冬酰胺合成酶a氨基酸序列的第53位的赖氨酸突变为丙氨酸、第71位的组氨酸突变为缬氨酸、第100位的精氨酸突变为丙氨酸、第110位的组氨酸突变为谷氨酸、第214氨酸突变为谷氨酸、第218位的酪氨酸突变为甘氨酸其中的一种或组合获得。
2.如权利要求1所述的天冬酰胺合成酶a突变体，其特征在于：所述天冬酰胺合成酶a的氨基酸序列如seq id no.1所示；
3.编码权利要求1所述突变体天冬酰胺合成酶a的基因。
4.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒包含权利要求3所述...
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