一种细胞表面展现式快速筛选抗体表达细胞的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了提供了一种细胞表面展现式快速筛选抗体表达细胞的方法。该方法主要通过对抗体表达细胞引入并表达带有抗体结合能力的蛋白A/G相关的cDNA序列，该序列表达物是一种含信号肽、IgG结合区和跨膜区的蛋白质。该蛋白质与抗体分子的复合物最终随囊泡转运至质膜后，便会出现于细胞表面。利用抗原与抗体的特异性结合，筛选到相应的分泌细胞。本发明专利技术能够避免常规单抗筛选中的繁琐的多孔平板培养、检测和筛选过程，不需要抗性条件，大幅节省时间和人力物力，缩短抗体制作周期。

A method of rapid screening antibody expressing cells by cell surface display

【技术实现步骤摘要】
一种细胞表面展现式快速筛选抗体表达细胞的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种细胞表面展现式快速筛选抗体表达细胞的方法。
技术介绍
抗体是指抗原刺激机体后，由B淋巴细胞或浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。其中，由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅识别某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体，简称单抗。它具有特异性强、纯度高、均一性好等优点。第一代单抗由Kohler和Milstein在1975年制备，它是来源于小鼠B细胞杂交瘤的抗绵羊红细胞的单克隆抗体。近年来，随着研究的不断深入，越来越多的单克隆抗体药物被发掘并应用于治疗肿瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾病，尤其是在肿瘤免疫治疗中显示出良好的前景。单克隆抗体与抗血清(又称多克隆抗体，多抗)的主要差别是单抗为单一B细胞克隆所产生的一种均一的免疫球蛋白分子。最常用的单抗是小鼠的单克隆抗体，制备单克隆抗体的技术又称杂交瘤技术。杂交瘤技术的基本原理是用分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能在体外长期培养并可低温保存的肿瘤细胞进行杂交，经筛选得到既能分泌抗体又有瘤细胞的特性的杂交瘤细胞。用单克隆化的杂交瘤细胞就可以进行单克隆抗体的生产，目前较常见的为鼠单抗，兔单抗和其它物种单抗也已逐渐开始生产但仍未形成规模。小鼠的单抗技术虽然已经很成熟，但其多孔平板培养与检测等筛选过程比较繁琐，周期较长。过多的步骤还可能会导致抗体筛选质量的下降，从而最终影响筛选结果的好坏。本专利技术的特点是通过引入新技术，优化和简化单克隆抗体筛选过程，缩短筛选时间，提高筛选质量，为单抗筛选提供全新模式，为目前单抗筛选方法提供简化与优化手段，为难以进行的其他动物及人单克隆抗体的制备提供有力的技术支撑。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际需求，本专利技术提供了一种细胞表面展现式快速筛选抗体表达细胞的方法，该方法能够大大缩短筛选周期，省时省力，能显著提高工作效率。本专利技术要解决的技术问题通过以下技术方案得以实现：一种细胞表面展现式快速筛选抗体表达细胞的方法，其包括如下步骤：构建一种质粒或病毒表达体系，所述表达体系转染或感染细胞后表达含有信号肽、IgG结合区和C-末端跨膜区结构的蛋白；所述抗体与所述蛋白相结合而展现于细胞表面。进一步地，所述方法进一步包括：筛选抗体表达细胞，通过荧光标记或磁珠交联的抗原与抗体结合的方法筛选抗体的分泌细胞。优选地，所述表达体系为pLVX-Puro-TETON载体。优选地，所述pLVX-Puro-TETON载体是在PLVX-Puro载体的位点XhoI和EcoRI之间插入TET操纵子序列得到。优选地，所述抗体为单克隆抗体。优选地，所述抗体为多克隆抗体。进一步地，所述方法包括如下步骤：1)构建病毒表达体系，所述表达体系携带编码含有信号肽、IgG结合区和C-末端跨膜区结构的proteinA/G的cDNA序列；2)制备重组病毒悬液；3)筛选抗体表达细胞。进一步地，所述筛选抗体表达细胞，包括如下步骤：(1)稳定表达细胞表面proteinA/G的骨髓瘤细胞株的建立：将重组病毒悬液感染骨髓瘤细胞，利用嘌呤霉素抗性筛选得到稳定表达proteinA/G的骨髓瘤细胞株；(2)proteinA/G表达的骨髓瘤细胞株与抗体表达细胞的融合：将proteinA/G表达的骨髓瘤细胞株与特定抗原免疫后的小鼠脾脏B细胞融合并培养12小时，移去培养液，用PBS洗两遍，再加含四环素或强力霉素的细胞培养培养4-8小时，然后将细胞收集于离心管中；(3)抗原磁珠与抗体表达细胞的结合：将交联有抗原的磁珠加进步骤(2)收集有细胞的离心管中轻摇半小时，在磁场条件下洗去未与磁珠结合的细胞；(4)用抗原洗脱细胞并进行混合或单克隆化培养：将所收集细胞在不含有四环素和强力霉素的培养液中培养，然后进行多克隆抗体检测和单克隆优化细胞株的筛选；(5)鉴定和保存细胞株。优选地，所述cDNA序列可设有表达开关。优选地，所述开关为四环素控制开关。与现有技术相比，本专利技术取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：本专利技术方法能使正常分泌抗体细胞展现出细胞表面结合形式的抗体，从而有利于特异性筛选；本专利技术方法能够避免常规单抗筛选中的繁琐的多孔平板培养、检测和筛选过程；本专利技术方法筛选培养不需要抗性条件，大幅节省时间和人力物力，缩短抗体制作周期；本专利技术方法还可以保存和制备特异性多抗，延伸至其他动物和人的不同单抗的制备。说明书附图图1：传统鼠单抗制备流程图；图2：本专利技术鼠单抗制备流程图；图3：包含信号肽、IgG结合区和C-末端跨膜区的cDNA表达框；图4：正常细胞与特化细胞所表达抗体在胞内合成运输以及分泌的图；图5：本专利技术筛选方法与传统方法比较图；图6：磁珠筛选流程图；图7：磁珠筛选示意图。具体实施方式为了使本专利技术的技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明，但本专利技术并非局限在实施例范围内。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行操作。实施例1专利技术简述本专利技术构建一种质粒或病毒表达体系使之转染或感染细胞后表达含有信号肽、IgG结合区和C-末端跨膜区结构的一种蛋白，这蛋白由于有信号肽序列所以与抗体分子一样在内质网中合成，因而合成后与抗体分子结合。这样，原本分泌至细胞外的抗体分子由于与该膜蛋白分子的结合而出现于细胞表面。通过荧光标记的或磁珠交联的抗原与特异抗体结合等手段，可以简便而高效地筛选到特异抗体分泌细胞；本专利技术构建瞬时表达或稳定表达的质粒或病毒系统，这表达质粒或系统含有特定cDNA能表达一种包含信号肽、IgG结合区和C-末端跨膜区的蛋白。该cDNA的表达控制区可加设表达开关(四环素控制开关或类似装置)以利于对抗体表达细胞的筛选和抗体制备。当特定cDNA被引进抗体表达细胞后，所表达的蛋白产物可将该细胞产生的抗体以细胞膜结合形式出现于细胞表面。表达有表面结合形式的抗体的细胞可通过多种途径得到包括：1.利用荧光标记的抗原对特异抗体表达细胞(包括B细胞或与瘤细胞融合后的抗体表达细胞)进行标记并通过流式分选系统分选出来；2.将抗原交联到磁珠上通过磁场作用将特异抗体表达细胞被吸附而与其它细胞分离出来。如图3所示，构建了包含信号肽、IgG结合区和C-末端跨膜区的cDNA表达框，由编码信号肽、IgG结合区、跨膜区和一小段C-末端胞内区组成的DNA序列。如图6所示，在与B细胞融合之前,特化骨髓瘤细胞表达控制装置设为“关”状态，以避免游离的IgG与特定表面产物结合而造成假阳性。与B细胞融合后，特化骨髓瘤细胞表达控制装置设为“开”状态，从而使特定蛋白表达、与IgG结合和一起出现于细胞表面从而有利于特异性筛选。当完成筛选工本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞表面展现式快速筛选抗体表达细胞的方法，其包括如下步骤：构建一种质粒或病毒表达体系，所述表达体系转染或感染细胞后表达含有信号肽、IgG结合区和C-末端跨膜区结构的蛋白；所述抗体与所述蛋白相结合而展现于细胞表面。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞表面展现式快速筛选抗体表达细胞的方法，其包括如下步骤：构建一种质粒或病毒表达体系，所述表达体系转染或感染细胞后表达含有信号肽、IgG结合区和C-末端跨膜区结构的蛋白；所述抗体与所述蛋白相结合而展现于细胞表面。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：筛选抗体表达细胞。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述表达体系为pLVX-Puro-TETON载体。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述pLVX-Puro-TETON载体是在PLVX-Puro载体的位点XhoI和EcoRI之间插入TET操纵子序列得到。


5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。


6.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体。


7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)构建病毒表达体系，所述表达体系携带编码含有信号肽、IgG结合区和C-末端跨膜区结构的proteinA/G的cDNA序列；
2)制备重组病毒悬液，收集重组病毒颗粒；
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【专利技术属性】
技术研发人员：苏庆宁，苏文颀，张艺，李世和，
申请(专利权)人：澳世科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44