一种结核分枝杆菌免疫原蛋白ESAT6的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种结核分枝杆菌免疫原蛋白ESAT6的制备方法。本发明专利技术提供了一种CFP10‑ESAT6重组融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该重组融合蛋白表达量高且为上清表达、活性好；纯化该重组融合蛋白后，经酶切、镍柱分离，洗脱，制备得到了结核分枝杆菌免疫原蛋白ESAT6；该方法制备得到的ESAT6蛋白的表达量高、抗原性好、活性好、纯度高，解决了ESAT6蛋白抗原性较差、可溶性不好、原核表达大部分为包涵体的问题，为结核病的早期诊断和新型疫苗的研制奠定了基础，具有广泛的应用前景。

A preparation method of Mycobacterium tuberculosis immunogen protein ESAT6

【技术实现步骤摘要】
一种结核分枝杆菌免疫原蛋白ESAT6的制备方法
本专利技术属于生物医药
更具体地，涉及一种结核分枝杆菌免疫原蛋白ESAT6的制备方法。
技术介绍
结核病是由结核分枝杆菌(MTB)感染引起的传染病，据WHO发布的2019年全球结核病报道，目前全世界1/4的人口感染了结核分枝杆菌，每年约有1000万新病例发生，HIV阴性人群中，结核病导致约有120万人死亡。我国是世界上30个结核病高负担国家之一，据全国第四次结核病流行病学调查的数据，全国受结核分枝杆菌感染人数超过4亿。因此，如何早期发现及预防结核病日益引起了世界范围的重视。ESAT6蛋白是一种结核分枝杆菌早期分泌性蛋白，没有信号肽，其可能是通过一种非信号肽依赖方式分泌到胞外。ESAT6蛋白在常规普通培养基上生长时，结核分枝杆菌分泌ESAT6蛋白量很低，但在感染的巨噬细胞内生长时，ESAT6蛋白表达量明显提高，这种变化被称为巨噬细胞诱导效应。ESAT6蛋白在结核分枝杆菌增殖期和非增殖期都高水平的转录，因此，无论是活动性结核患者还是结核分枝杆菌潜伏感染者，ESAT6蛋白都能有效诱导机体的免疫应答。ESAT6蛋白的分布特异性和良好的免疫性决定其可能作为新型疫苗的候选抗原，用于结核病预防或作为特异性抗原用于结核病诊断。已有研究表明，ESAT6蛋白作为抗原检测结核分枝杆菌潜伏感染优于TST，ESAT6、CFP10的样品血液检测方法的敏感性和特异性优于PPD皮试。现有技术中，温见翔等(2004)公开了结合分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化，成功制备得到了结合分枝杆菌ESAT-6蛋白。但是，该制备ESAT6蛋白的方法中，仍然存在增加融合蛋白成分，得到的ESAT6蛋白的抗原性较差；或者得到的ESAT6蛋白的抗原性好，但原核表达的ESAT6蛋白大部分以包涵体形式存在于沉淀中，少数以可溶性的形式存在于裂菌上清液中，得到的ESAT6蛋白分子量小，进而导致可溶性蛋白的表达量不高、回收率低的问题。因此，研发一种表达量高、抗原性好、活性好、纯度高的ESAT6蛋白的制备方法，对于利用ESAT6蛋白进行结核病早期诊断以及新型结核病疫苗的研制具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是弥补现有ESAT6蛋白的制备方法的不足，提供一种结核分枝杆菌免疫原蛋白ESAT6的制备方法。本专利技术的目的是提供一种CFP10-ESAT6重组融合蛋白。本专利技术另一目的是提供编码所述重组融合蛋白的CFP10-TEV-ESAT6融合基因。本专利技术又一目的是提供所述重组融合蛋白或所述融合基因在制备结核分枝杆菌免疫原蛋白ESAT6中的应用。本专利技术再一目的是提供一种结核分枝杆菌免疫原蛋白ESAT6的制备方法。本专利技术再一目的是提供所述方法制备得到的免疫原蛋白ESAT6。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术首先提供了一种CFP10-ESAT6重组融合蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。优选地，所述CFP10-ESAT6重组融合蛋白的制备方法为：扩增CFP10基因和ESAT6基因并与质粒pET-28a连接，构建pET-28a-CFP10-ESAT6重组质粒，在BL21(DE3)大肠杆菌中诱导表达，即得所述CFP10-ESAT6重组融合蛋白。本专利技术还提供了编码所述重组融合蛋白的CFP10-TEV-ESAT6融合基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。所述重组融合蛋白或所述融合基因在制备结核分枝杆菌免疫原蛋白ESAT6中的应用，也应在本专利技术的保护范围之内。本专利技术还提供了一种结核分枝杆菌免疫原蛋白ESAT6的制备方法，纯化所述的重组融合蛋白后，经酶切、镍柱分离，洗脱，即得所述免疫原蛋白ESAT6。优选地，所述方法包括以下步骤：S1.将所述的重组融合蛋白依次经过镍柱亲和层析、层析除盐和阴离子交换层析进行纯化；S2.将步骤S1纯化后的重组融合蛋白用蛋白酶TEV酶切，镍柱分离，收集流穿；S3.将步骤S2得到的流穿用1％～3％曲拉通处理后，洗脱，即得所述免疫原蛋白ESAT6。优选地，步骤S1所述镍柱亲和层析所用的洗涤缓冲液包括10～50mMTris-HCl和50～80mM咪唑。更优选地，步骤S1所述镍柱亲和层析所用的洗涤缓冲液包括20mMTris-HCl和60mM咪唑。优选地，步骤S1所述镍柱亲和层析所用的洗脱缓冲液包括10～50mMTris-HCl和250～300mM咪唑。更优选地，步骤S1所述镍柱亲和层析所用的洗脱缓冲液包括20mMTris-HCl和300mM咪唑。优选地，步骤S1所述阴离子交换层析所用的洗脱缓冲液包括10～50mMTris-HCl和0～0.5MNaCl。更优选地，步骤S1所述阴离子交换层析所用的洗脱缓冲液包括10mMTris-HCl和0.5MNaCl。优选地，步骤S3所述洗脱为：经第一平衡缓冲液和第二平衡缓冲液淋洗后，用洗脱缓冲液洗脱。优选地，所述第一平衡缓冲液包括10～50mMTris-HCl和1％～3％曲拉通。更优选地，所述第一平衡缓冲液包括20mMTris-HCl和2％曲拉通。优选地，所述第二平衡缓冲液为10～50mMTris-HCl。更优选地，所述第二平衡缓冲液为20mMTris-HCl。优选地，所述洗脱缓冲液包括10～50mMTris-HCl和250～300mM咪唑。更优选地，所述洗脱缓冲液包括20mMTris-HCl和300mM咪唑。优选地，本专利技术中所述Tris-HCl的pH为7.5～8.5。更优选地，本专利技术中所述Tris-HCl的pH为8。另外，所述方法制备得到的免疫原蛋白ESAT6，也应在本专利技术的保护范围之内。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种结核分枝杆菌免疫原蛋白ESAT6的制备方法。本专利技术利用原核表达系统，获得分泌表达量高、活性好的CFP10-ESAT6重组融合蛋白后，经纯化、酶切、镍柱分离CFP10-ESAT6重组融合蛋白和CFP10蛋白，得蛋白ESAT6；其中，CFP10-ESAT6重组融合蛋白表达量高且为上清表达、活性好，进而使得ESAT6蛋白的表达、纯化更加高效；该方法制备得到的ESAT6蛋白的表达量高、抗原性好、纯度高(高达95％以上)、活性好，1L目标工程菌发酵液可制备ESAT6蛋白3mg，解决了ESAT6蛋白抗原性较差、可溶性不好和包涵体表达等问题，为结核病的早期诊断和新型疫苗的研制奠定了基础，具有广泛的应用前景。附图说明图1是CFP10-ESAT6重组融合蛋白的结构示意图；其中，CFP10代表目的基因CFP10，ESAT6代表目的基因ESAT6，TEV代表蛋白酶TEV，HIS代表HIS标签。图2是CFP10-ESAT6重组融合蛋白镍柱亲和层析电泳图；其中，1为上Ni柱前，2为Ni柱流穿，3为60mM咪唑洗涤，4为300m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CFP10-ESAT6重组融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种CFP10-ESAT6重组融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.编码权利要求1所述重组融合蛋白的CFP10-TEV-ESAT6融合基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.权利要求1所述重组融合蛋白或权利要求2所述融合基因在制备结核分枝杆菌免疫原蛋白ESAT6中的应用。


4.一种结核分枝杆菌免疫原蛋白ESAT6的制备方法，其特征在于，纯化权利要求1所述的重组融合蛋白后，经酶切、镍柱分离，洗脱，即得所述免疫原蛋白ESAT6。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将权利要求1所述的重组融合蛋白依次经过镍柱亲和层析、层析除盐和阴离子交换层析进行纯化；
S2.将步骤S1纯化后的重组融合蛋白用蛋白酶TEV酶切，镍柱分离，收集流穿；
S3.将步骤S2得到的流穿用1％～3％曲拉通处理后，洗脱，即得所述免疫原蛋白ESAT6。
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【专利技术属性】
技术研发人员：周亚凤，申兆兴，黎勇，宋淑婷，
申请(专利权)人：上海晶诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31