本发明专利技术公开了一种检测结核分枝杆菌耐药基因的试剂盒及其应用。本发明专利技术公开一组检测或辅助检测样品中结核分枝杆菌的基因是否发生耐药性突变的探针，该组探针包含序列为如下(1)-(20)任意所示序列的探针中的至少一个：(1)SEQ ID No.13所示的序列；(2)SEQ ID No.14所示的序列；(3)SEQ ID No.15所示的序列；(4)SEQ ID No.16所示的序列。本发明专利技术通过高效灵敏的多重实时荧光PCR技术，在较短的时间内检测待测样品中结核分枝杆菌的七个耐药基因的突变情况，结果灵敏度高、特异性较好，分析过程简便。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于生物技术领 域。
技术介绍
结核病是单一致病菌感染导致死亡率最高的感染性疾病。目前，全球约有1/3的 人感染了结核杆菌，每年死于结核病的人数达到300万。我国是全球22个结核病流行严重 的国家之一，位居全球第2位。第五次全国结核病流行病学抽样调查显示，全国15岁及以 上人群肺结核的患病率为459/10万，肺结核患者耐多药率为6. 8%。结核病与艾滋病等疾 病伴发以及多药耐药等现象致使我国结核病的防控形势严峻。 结核分枝杆菌耐药性的机制大致有三种类型：即降低细胞膜的通透性和外排泵机 制，产生降解或灭活酶类，药物靶位的改变。结核杆菌无法通过质粒的介导从其他细菌获得 耐药性，因此染色体介导的耐药性是MTB(结核分枝杆菌）产生耐药的主要基础。目前对 MTB耐药分子机制的研宄主要集中在药物的作用靶位及其相关基因的突变上。 利福平作用于结核杆菌DNA依赖的RNA聚合酶亚基|3亚单位（RNApolymerase Bsubunit，rpoB)，从而抑制mRNA的转录。结核分枝杆菌对利福平耐药是结核病化疗失败 的主要原因，当rpoB高度保守核心区域（RRDR)发生突变时利福平不能与RNA聚合酶0亚 单位结合，抑制转录。主要的突变集中在编码27个氨基酸的81个碱基范围内（Hillemann Detal.UseOftheGenotypeMTBDRassayforrapiddetectionofrifampinand isoniazidresistanceinMycobacteriumtuberculosiscomplexisolates.J.Clin. Mierobiol，2005,43 :3699-3703.)。其中，以 531TCG-TTG、526CAC-GAC、CAC-TAC、 CAC-CGC和CAC-CTC的突变最为常见（崔振玲等.基因芯片检测结核分枝杆菌利福 平和异烟肼耐药性研宄.中华结核与呼吸杂志，2004,7(27) :439-441.)，除上述两位点 外，511、516、533、522位点也有突变。 结核分枝杆菌对抗结核化疗药物异烟肼（INH)的耐药机制较为复杂，约92%的 INH耐药菌与katG，inhA和ahpC三个基因突变有关。其中katG和inhA基因是主要的耐 药基因。katG的丢失或突变导致其编码的过氧化氢-过氧化物酶活性丧失或下降，而inhA 基因突变减弱了异烟肼对分枝杆菌酸生物合成的抑制作用。katG基因常见突变发生在315 位点上即315AGC-AAC或者AGC-ACC，inhA基因的突变位点为-15C-T。 最近的研宄表明结核分枝杆菌耐乙胺丁醇与阿拉伯糖基转移酶的编码基因。 embABC操纵子突变或emb蛋白表达增高有关，该操纵子由embC、embA和embB三个基 因组成，其中embB基因（尤其是306位密码子）突变是耐乙胺丁醇产生的主要分子机 制。约47%_65%的耐￡]\?菌株与611^13基因突变有关（1^11^8￥31117 3 6七31.]\1〇16(31113『 geneticanalysisofnucleotidepolymorphismsassociatedwithethambutol resistanceinhumanisolatesofMycobacteriumTuberculosis?AntimicrobAnents Chemother. 2000,44 (2) :32.)，常见突变位点为 306ATG-ATA或ATG-GTG。 链霉素是抗结核治疗中常用的氨基糖苷类抗生素，链霉素主要作用于结核分枝杆 菌的核糖体，诱导遗传密码的错误，抑制mRNA转译的开始，干扰转译过程中的校对，从而 抑制蛋白质合成（HonoreN，ColeST.Streptomycinresistanceinmycobactefia. AnlimiorobAgentsChemother，1994,38(2):238.)。最近研宄认为链霉素耐药是由于其核 糖体S12蛋白编码基因rpsL或16SrRNA编码基因rr8突变所致，80%耐链霉素结核分枝杆 菌临床分离株可见rpsL突变（李国利.结核分枝杆菌耐药分子机制及耐药基因检测方法 研宄进展.中国医师杂志，2002,4(4) :338-340.)。rpsL基因最常见的是43位密码子 AAG-AGG的突变和88位密码子AAG-AGG的突变。 氟喹诺酮类药物的作用靶位是细菌的DNA旋转酶，阻抑DNA的复制，最终导致菌体 死亡。喹诺酮类耐药结核菌中，突变大多发生在gyrA基因保守区67-106位的密码子区。常 见94位GAC-GGC的突变位点，90位GCG-GTG的突变位点。 卡那霉素（Kanamycin，KAN)和阿米卡星（Amikacin，AMK)是氨基糖苷类 抗生素，它们结合到细菌核糖体30S亚基的16SrRNA，干扰甲酰甲硫氨酰tRNA(. formyl-methionyl-tRNA)与30SrRNA的连接，阻断细菌蛋白质的合成，从而达到抑菌的作 用。 卷曲霉素（Capreomycin,CAP)为多肽复合物，对结核分枝杆菌起抑制作用，但作 用机制尚不明确，可能与抑制细菌蛋白合成有关。 耐阿米卡星（AK)、卡那霉素的结核杆菌中，16SrRNA基因突变率为67. 4%，最常 见的突变型是1401(A-G)的单碱基置换（60. 5% )。少数分离株为1402(C-T或A)， 1484(G-T)，这些突变主要发生于高水平耐药株，还有32. 6 %的耐卡那霉素分离株未发现 16SrRNA基因突变，可能还存在其他耐药机制。 卷曲霉素耐药与相关基因突变关系密切，包括16SrRNA基因和tlyA基因，但是， 最主要的耐药基因是16SrRNA基因，大约78-80%的卷曲霉素耐药性与该基因的突变相 关，特别是1401(A-G)的单碱基置换，突变率约为72%，但此突变型仅造成卷曲霉素低度 耐药，1402(C-T)和1484(G-T)的突变率较低，约为5-6%，但它们可导致菌株对卷曲霉 素高度耐药。 结核分枝杆菌的临床检测一直以来主要依靠药物药敏试验，但传统的在固体培养 基上进行的药物敏感试验周期长、敏感性低，严重影响了患者的早期诊断和治疗。 因此，建立一种操作简便、快速的检测耐药基因多点突变方法对指导结核病的治 疗和控制具有极其重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。 本专利技术提供一组检测或辅助检测样品中结核分枝杆菌的基因是否发生耐药性突 变的探针，该组探针包含序列为如下（1)_(20)任意所示序列的探针中的至少一个： (l)SEQIDNo. 13 所示的序列； (2)SEQIDNo. 14 所示的序列； (3)SEQIDNo. 15 所示的序列； (4)SEQIDNo. 16 所示的序列； (5)SEQIDNo. 17 所示的序列； (6)SEQIDNo. 18 所示的序列； (7)SEQIDNo. 19 所示的序列； (8)SEQIDNo. 20 所示的序列； (9)SEQIDNo. 21 所示的序列； (10)SEQIDNo. 22 所示的序列； (11)SEQIDNo. 23 所示的序列； (12)SEQIDNo本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组检测或辅助检测样品中结核分枝杆菌的基因是否发生耐药性突变的探针，该组探针包含序列为如下(1)‑(20)任意所示序列的探针中的至少一个：(1)SEQ ID No.13所示的序列；(2)SEQ ID No.14所示的序列；(3)SEQ ID No.15所示的序列；(4)SEQ ID No.16所示的序列；(5)SEQ ID No.17所示的序列；(6)SEQ ID No.18所示的序列；(7)SEQ ID No.19所示的序列；(8)SEQ ID No.20所示的序列；(9)SEQ ID No.21所示的序列；(10)SEQ ID No.22所示的序列；(11)SEQ ID No.23所示的序列；(12)SEQ ID No.24所示的序列；(13)SEQ ID No.25所示的序列；(14)SEQ ID No.26所示的序列；(15)SEQ ID No.27所示的序列；(16)SEQ ID No.28所示的序列；(17)SEQ ID No.29所示的序列；(18)SEQ ID No.30所示的序列；(19)SEQ ID No.31所示的序列；(20)SEQ ID No.32所示的序列；所述基因为rpoB基因、katG基因、inhA基因、rpsL基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐洪涛，王璨，项光新，邢婉丽，程京，梁建琴，赵雁林，
申请(专利权)人：博奥生物集团有限公司，清华大学，中国人民解放军第三○九医院，中国疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：北京;11
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