转基因大豆MON89788及其衍生品种的LAMP检测引物组、检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种转基因大豆MON89788及其衍生品种的LAMP检测引物组、检测试剂盒和检测方法。检测引物组包括四条特异性引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照；试剂盒还可以有显色剂或荧光指示剂；其检测方法是通过提取待检大豆品种的DNA、采用四条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在60～65℃对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增效率可达到109～1010个拷贝，其鉴定采用反应管内沉淀的浊度变化、加入显色剂观察反应管内颜色变化、利用实时荧光检测仪观察确定待检大豆品种是否含有或为转基因大豆MON89788及其衍生品种。本发明专利技术具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种转基因大豆MON89788及其衍生品种的LAMP检测引物组、检测试剂盒和检测方法。检测引物组包括四条特异性引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照；试剂盒还可以有显色剂或荧光指示剂；其检测方法是通过提取待检大豆品种的DNA、采用四条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在60～65℃对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增效率可达到109～1010个拷贝，其鉴定采用反应管内沉淀的浊度变化、加入显色剂观察反应管内颜色变化、利用实时荧光检测仪观察确定待检大豆品种是否含有或为转基因大豆MON89788及其衍生品种。本专利技术具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。【专利说明】转基因大豆M0N89788及其衍生品种的LAMP检测引物组、检测试剂盒和检测方法
本专利技术属于分子生物学
，涉及转基因植物品种的检测方法，具体涉及转基因大豆M0N89788及其衍生品种的LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
自1996年以来，全球转基因作物的种植面积实现了非凡增长，特别是其中有12年的增长率达到两位数。2013年是转基因作物种商业化的第18年(1996 — 2013)，国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)发表《2013年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势》的报告，报告显示:过去18年内全球30多个国家数百万农民以空前的比例种植了转基因作物，这些农民独立作出了 100多万次种植和再种植转基因作物的决定，累计种植面积超过16亿公顷，这个面积大体相当于或者超过美国或中国150%的国土面积，再次种植率高达为100%。2013年，全球27个国家的1800万农民种植了共1.752亿公顷的转基因作物。 然而，与转基因作物产业化的蓬勃发展相对应的是各国民众对其安全性的担忧，主要包括对人和动物健康的风险，对生态环境与农业的风险，对非目标生物的风险。针对第一种风险，1993年，联合国经济发展与合作组织(OECO)提出了食品安全性评估的“实质等同性”原则。如果准基因作物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的。最早提出对转基因食品进行标识管理的是欧盟，1998年，欧盟在世界上签署第一个法案，要求对转基因产品进行标签说明；1999年，要求出口到欧盟的非转基因产品不得含有1%的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最低限量降低到0.9%。日本，澳大利亚，新西兰对转基因成分的最低含量做了不同规定，阈值从I?5%不等。 我国自2001年起相继颁布了一系列法律法规，对大豆、玉米、棉花、油菜、番茄5类转基因作物的17种产品实施强制性定性标识。2013年12月，国家主席习近平就转基因技术发表《占领转基因技术制高点》的专题讲话，他明确指出，“我强调两点:一是确保安全，二是要自主创新。也就是说，在研究上要大胆，在推广上要慎重。转基因农作物产业化、商业化推广，要严格按照国家制定的技术规程规范进行，稳打稳扎，确保不出闪失，涉及安全的因素都要考虑到。要大胆创新研究，占领转基因技术制高点，不能把转基因农产品市场都让外国大公司占领了。”由此可见，国家对转基因产品安全性的重视程度。 卞MXGlycine ffiar)是一种其种子含有丰富的蛋白质的豆科植物,原产国为中国，至今已有5000年的种植史。1996年以来中国开始大量进口大豆，进口量相当于我国的大豆产量。我国进口的大豆主要来自美国、阿根廷和巴西。这三个国家均为转基因大豆种植大国。其中，从美国进口的转基因大豆就占进口总量的89%。抗草甘膦大豆M0N89788是美国孟山都公司研发的第2代转基因大豆品种，也称作RR2Y (Roundup RReady2 Yield?)。M0N89788大豆在美国、加拿大等国家获准商业化种植，并已于2008年获准进口我国用作加工原料。 不言而喻，建立有效的转基因作物的检测方法与体系，对转基因作物及其产品标识制度的实施和安全性评价具有十分重要的意义。目前，转基因作物的检测方法主要有以下2类:1)基于蛋白质的检测，如酶联免疫吸附法(ELISA)试纸条检测、Western杂交等方法检测，这类方法要求高质量、高稳定性的抗体，否则会影响检测的准确性，因此只能作为辅助检测手段；2)基于核酸的检测,如核酸分子杂交技术(Sourthernblot)和PCR检测技术,其中PCR检测方法是最主要、最准确的检测转基因作物的方法，但这类方法的反应体系和操作过程比较复杂，需要专业人员；所需PCR仪价格在5万元左右，扩增时间2?3小时，扩增结果的电泳时间需要I小时左右；电泳常用染料EB为强致癌物质，有较强毒性，且难以实行现场检测。 综上所述，在科学研究和生产实践中均需要一种快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠且适用于现场操作的转基因作物检测方法。 环介导等温基因扩增技术(Loop-MediatedIsothermal Amplificat1n,以下简称LAMP法)是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，其具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，目前尚未有将恒温扩增目视检测技术、恒温实时荧光技术应用于快速检测转基因大豆M0N89788及其衍生品种的试剂盒
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种转基因大豆M0N89788及其衍生品种的LAMP检测引物组。 本专利技术的另Iv目的在于提供一种转基因大? Μ0Ν89788及其衍生品种的LAMP检测试剂盒。 本专利技术的另一个目的在于提供一种基于上述检测引物组和检测试剂盒的转基因大豆M0N89788及其衍生品种的恒温基因扩增检测方法。 为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案:转基因大豆M0N89788及其衍生品种的LAMP检测引物组，包括外引物I和外引物2、内引物I和内引物2，其核苷酸序列分别如下所示: 外引物 I:TTCCTGCTCCACTCTTCC (SEQ ID No:1)； 外引物 2:GCTAATGGTTTGGAGACTCTG (SEQ ID No:2)； 内引物 1:AGAGCTTGATGGGGATCAGATTGTCGCTTCAATCGTGGTTATCA (SEQ ID No:3);内引物 2:GTTATCAAGCTTCTGCAGGTCCTGTACCCTGACCTTGTTGAGG (SEQ ID No:4)。 转基因大豆M0N89788及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，包括以下成分:(O引物液:含有权利要求1所述的引物组，浓度分别为48?52μ M外引物1、48?52 μ M夕卜弓丨物2，48?52 μ M内引物1、48?52 μ M内引物2 ; (2)反应液:含有12mM dNTP> 10X Isothermal Amplificat1n 反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液，三者的体积比是7?9:4?6:2 ; (3)DNA聚合酶:浓度为7?9υ/μ I ;(4)对照:阳性对照为转基因大豆Μ0Ν89788的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。 作为本专利技术进一步的方案:所述引物液中本文档来自技高网...

【技术保护点】
转基因大豆MON89788及其衍生品种的LAMP检测引物组，其特征在于，包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2，其核苷酸序列分别如下所示：外引物1：TTCCTGCTCCACTCTTCC（SEQ ID No：1）；外引物2：GCTAATGGTTTGGAGACTCTG（SEQ ID No：2）；内引物1：AGAGCTTGATGGGGATCAGATTGTCGCTTCAATCGTGGTTATCA（SEQ ID No：3）；内引物2：GTTATCAAGCTTCTGCAGGTCCTGTACCCTGACCTTGTTGAGG（SEQ ID No：4）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李海鹏，方雪恩，王丽娟，曹宏梅，陈旭，徐凌佳，孔继烈，
申请(专利权)人：上海速芯生物科技有限公司，复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31