一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr‑1的LAMP引物组、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的LAMP引物组、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及病原微生物的检测，具体涉及一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的LAMP引物组、试剂盒及检测方法。
技术介绍
多粘菌素属于阳离子多肽抗生素家族，有A、B、C、D、E五种，抗菌谱相互类似而范围宽广，通常被认为是对抗耐多药革兰氏阴性细菌感染的最后一道防线，临床上常用的是多粘菌素B（polymyxinB）和多粘菌素E（colistin，黏菌素）。近年来，发现了一个新的基因mcr-1，可使细菌对多粘菌素产生高度耐药性，其广泛存在于取自中国南方的猪和患者的肠杆菌科细菌中，包括具有流行可能性的菌株。已知，mcr-1基因产物属于磷酸乙醇胺转移酶家族，能够催化磷脂酰乙醇胺转移到脂质A的第四个磷酸基团上，使得脂质A的结构发生改变，从而降低了多粘菌素E与脂多糖的亲和力，介导多粘菌素耐药。mcr-1基因以质粒为载体存在于细菌中，能够以水平基因转移的方式在不同菌株中进行遗传物质的交换，这意味着mcr-1基因介导的耐药性可以在细菌中相互传播。各项研究表明，截止至2016年底，mcr-1基因已经在不少于16个国家中被发现，包括东南亚、柬埔寨和马来西亚的7个国家，9个欧洲国家。特别注意的是，质粒传播的mcr-1基因至少存在于3个肠道菌种中（大肠杆菌、沙门氏菌和克雷伯氏肺炎菌），宿主包括至少三种家禽和家畜（鸡、猪和牛），从而引发了公众对于其全球传播和扩散的担忧。因此，mcr-1基因的检测对于监控耐药细菌的爆发，指导患者感染用药具有重要作用。对于mcr-1基因的检测，传统的微生物培养法和药敏试验法能在临床上提供较好的价值，但因耗时长、繁琐的操作过程、需要昂贵的仪器设备等不同的原因未能在临床上大规模推广使用，因而研发一种简便、快速的细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的检测方法具有极大的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的LAMP引物组；本专利技术的另一个目的在于提供一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的试剂盒；本专利技术的另一个目的在于提供一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的LAMP引物组，其包括一对内引物、一对外引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：内引物1：5’-GCGATGGGATAGGTTTGGCTGTGTTGCCGTTTTCTTGAC-3’；内引物2：5’-TGCTGACGATCGCTGTCGGCACATAGCGATACGATGAT-3’；外引物1：5’-TGATGCAGCATACTTCTGTG-3’；外引物2：5’-GACCGTGCCATAAGTGTC-3’；环引物1：5’-AAGGTAAGATTGGCGGTCG-3’；环引物2：5’-CTACTGATCACCACGCTGTT-3’。一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所示的LAMP引物组。作为上述试剂盒的优选，LAMP引物组中，内引物、外引物、环引物的摩尔比为：(6～8)：(1～2)：(3～4)。作为上述试剂盒的改进，还含有DNA聚合酶、LAMP反应液、显色剂、阳性对照和阴性对照。作为上述试剂盒配方的优选，DNA聚合酶为BstDNA聚合酶。作为上述试剂盒配方的优选，LAMP反应液含有：10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液、5mM甜菜碱，四者的体积比为(6～8)：（4～5）：（2～3）：（8～10）。作为上述试剂盒配方的优选，显色剂为SYBRGREENⅠ。作为上述试剂盒配方的优选，阳性对照为含有细菌多粘菌素耐药基因mcr-1片段的质粒，阴性对照为DEPC水。一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的方法，包括如下步骤：（1）提取待检样品DNA；（2）利用LAMP引物组对待检样品DNA进行等温基因扩增反应；（3）结果判断：反应结束后，在反应管中加入1～2µL显色剂，混匀后即可观察反应液的颜色：若呈现绿色，判定为阳性，若呈现橙色，判定为阴性；上述方法所用的引物与试剂如权利要求1～8任一项所述；上述方法用于非疾病的诊断与治疗。作为上述方法的优选，等温基因扩增反应的25μL反应体系含有：内引物各8pmol/µL，外引物各1pmol/µL，环引物各4pmol/µL，反应液12.5µL，DNA聚合酶8U，待检DNA1～100ng，用灭菌去离子水补齐到25µL；等温基因扩增反应的条件为：60～65℃反应55～65min。本专利技术的有益效果是：本专利技术针对细菌多粘菌素耐药基因mcr-1特异性设计了6条引物，与目的基因的6个区域结合，具有较高的特异性，能准确识别细菌多粘菌素耐药基因mcr-1。本专利技术的试剂盒方便快捷，加入显色剂后即可观察结果，能在较短的时间内鉴别细菌多粘菌素耐药基因mcr-1，不需要昂贵的仪器设备，灵敏度高，特异性好，适合现场检测。附图说明图1：本专利技术对阴性样品和阳性样品的显色检测结果，图中，1：不含mcr-1基因的细菌粗提DNA（阴性样品）；2：细菌超广谱β-内酰胺酶耐药基因mcr-1样本（阳性样品）；图2：采用实施例2方法的检测灵敏度结果，图中，1为DEPC水，2～11为含有细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的pMD19-T质粒，浓度依次为1.0×10-0、1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109拷贝/μL；图3：采用常规PCR方法的检测灵敏度结果，图中，1为DEPC水，2～11为含有细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的pMD19-T质粒，浓度依次为1.0×10-0、1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109拷贝/μL，M为DNAMarker，条带至上而下为1200bp、900bp、700bp、500bp、300bp、100bp；图4：实施例4的特异性验证结果，图中，1：DEPC水，2：CTX-M-1，3：PME-1，4：SME-1，5：CMY-2，6：KPC-1，7：IMP-9，8：VIM-2，9：TEM，10：CTX-M-9，11：mcr-1。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1、快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的试剂盒的建立快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的试剂盒，包括以下成分：（1）LAMP检测引物组；（2）DNA聚合酶；（3）LAMP反应液；（4）显色剂；（5）阳性对照和阴性对照。（1）LAMP检测引物组根据细菌多粘菌素耐药基因mcr-1（GenBank登录号为：KX886345.1），针对其6个区域，进行LAMP引物设计，经过大量的引物特异性实验，优选出特异性好的的LAMP检测引物组，包括一对内引物、一对外引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：内引物1：5’-GCGATGGGATAGGTTTGGCTGTGTTGCCGTTTTCTTGAC-3’（SEQIDNO：1）；内引物2：5’-TGCTGACG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因

【技术特征摘要】
1.一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的LAMP引物组，其包括一对内引物、一对外引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：内引物1：5’-GCGATGGGATAGGTTTGGCTGTGTTGCCGTTTTCTTGAC-3’；内引物2：5’-TGCTGACGATCGCTGTCGGCACATAGCGATACGATGAT-3’；外引物1：5’-TGATGCAGCATACTTCTGTG-3’；外引物2：5’-GACCGTGCCATAAGTGTC-3’；环引物1：5’-AAGGTAAGATTGGCGGTCG-3’；环引物2：5’-CTACTGATCACCACGCTGTT-3’。2.一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所示的LAMP引物组。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：LAMP引物组中，内引物、外引物、环引物的摩尔比为：(6～8)：(1～2)：(3～4)。4.根据权利要求2所示的试剂盒，其特征在于：还含有DNA聚合酶、LAMP反应液、显色剂、阳性对照和阴性对照。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：DNA聚合酶为BstDNA聚合酶。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：LAMP...

【专利技术属性】
技术研发人员：田国宝，黄曦，钟兰兰，曾昆姣，沈聪，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44