本发明专利技术公开了一种构建石榴品种身份证的方法及其应用，该方法包括以下步骤：在苗期摘取不同石榴品种资源的叶片，用于DNA的提取；利用该SSR分子标记引物对，对提取的DNA进行PCR反应；电泳检测；数据分析。本发明专利技术构建了具查询功能的SSR指纹网络数据库，实现对不同地区石榴资源的准确区分，成功地将分子标记辅助选择育种技术应用于现实的石榴育种工作中，为检测单位和育种工作者提供了一个便利的网络数据交换和共享平台。在不同性状石榴的选育工作中，为杂交石榴品种真实性和纯度鉴定提供理论基础，可以显著降低石榴育种的工作量，提高亲本选择的准确性和目的性，缩短育种时间，极大地提高育种效率。
【技术实现步骤摘要】
一种构建石榴品种身份证的方法及其应用
本专利技术属于基因工程
，涉及一种构建石榴品种身份证的方法及其应用，具体地说，涉及一种利用SSR分子指纹和品种形态学特征特性等信息相结合，构建具有查询功能的石榴SSR指纹网络数据库。
技术介绍
石榴(PunicagranatumL.)别名安石榴、若榴、丹若、天浆、涂林等，为石榴科(Punicaceae)石榴属，落叶灌木或小乔木，原产于伊朗、阿富汗和高加索等中亚地区，在我国已有2000多年的栽培历史，是中国近年来发展迅速的优良小杂果类果树之一，目前形成了以新疆叶城、陕西临潼、河南开封、安徽怀远、山东峄城和云南蒙自等为中心的主要栽培区域，它以其较高的经济、营养、医药价值和保健功能，越来越受到消费市场的青睐。但由于异花授粉以及不同地域间的引种和品种交换，导致品种混杂、系谱不清，同物异名或同名异物现象严重。加之长期的无性繁殖和人类的偏好，使石榴基因型趋于单一，造成基因多样性降低，品种退化等现象。目前，石榴种质资源的远缘杂交已成为种质资源创新的一个重要途径。因此，明确不同性状品种的亲缘关系及评价石榴种质的遗传多样性，对石榴种质资源的保护、高效育种与有效利用具有重要的科学意义。然而石榴育种工作中没有一种准确有效的分子标记用于不同性状品种的亲缘关系及评价石榴种质的遗传多样性。国内外学者主要用形态学方法和分子标记技术对石榴进行研究。但形态学方法容易受季节和环境的影响，鉴定结果不准确。在分子水平上主要利用RAPD、AFLP、SRAP等技术进行石榴品种鉴定，而且多数集中在对某一地区的石榴品种进行研究，来源范围较窄，涉及的品种数量少，不够系统。因此，利用更稳定、更准确的分子标记技术鉴定石榴品种亲缘关系及评价遗传多样性势在必行。而且随着石榴种植面积迅速扩大，苗木品种混杂现象特别严重，给生产造成了极大的混乱。通过进行品种鉴定，可以对品种基本信息、品种分子身份证、品种间相似率和身份证核对等进行查询，确保品种的真实性和纯度，对优异石榴品种或材料实施产权保护具有十分重大的意义。同时还可指导杂交石榴品种真实性和纯度鉴定，分析亲本间遗传相似性，为杂交石榴新组合的选育提供亲本选配的参考。这对加快石榴良种化进程，促进产业发展，维护育种者和生产者的利益具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种构建石榴品种身份证的方法及其应用。本专利技术的目的之一在于提供一种基于该SSR位点开发的一种与石榴品种鉴定及用于扩增该标记的引物对。本专利技术的目的之二在于利用毛细管电泳SSR荧光标记分析，获取石榴品种的指纹信息，将指纹信息与石榴的品种形态学特征特性等信息等相结合，构建石榴品种身份证及其在石榴新品种选育工作中的应用。其具体技术方案为：一种构建石榴品种身份证的方法，包括以下步骤：步骤1、在苗期摘取不同石榴品种资源的叶片，用于DNA的提取；采用改良CTAB法提取石榴新鲜叶片的DNA(1)在65℃水浴中预热提前配置好的2×CTAB提取缓冲液(0.1MTris-HCl、0.02MEDTA、1.4MNaCl、2％PVP、2％CTAB)；(2)在液氮中研磨石榴叶片至粉末状，转至2.0mL离心管中；(3)迅速加入2×CTAB提取缓冲液1.0mL，10μlβ-巯基乙醇，混匀，65℃水浴60min，隔10-15min颠倒摇匀一次；(4)常温下12000rpm离心5min，吸上清转移至新的2.0mL离心管中；(5)加入等体积的氯仿/异戊醇，充分混匀5min，放置5min，12000rpm常温离心10min；(6)吸上清到新的2.0mL离心管中，用氯仿/异戊醇重复抽提一次；(7)离心，吸上清到新的离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，-20℃放置2h，沉淀DNA；(8)10000rpm常温离心10min；(9)倒掉异丙醇，用500μl乙醇洗沉淀两次，吹干后用100μlTE溶解DNA；(10)加入10mg/mlRNaseA2μl终浓度(200ng/ul)混匀，37℃保温2h以上；(11)加入500μlTE，再加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻颠倒摇匀2min；(12)12000rpm常温离心10min；(13)吸上清到新的离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，-20℃放置2h，沉淀DNA(14)12000rpm常温离心10min；(15)倒掉异丙醇，用500μl乙醇清洗沉淀两次，吹干后用50μlTE溶解DNA；4℃冰箱中保存；(16)使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。步骤2、利用该SSR分子标记引物对，对提取的DNA进行PCR；用于石榴品种指纹分析的13对SSR核心标记引物，由北京阅微生物技术有限公司合成，并分别用FAM(蓝色)、HEX(绿色)、TAMRA(黄色)、ROX(红色)4种荧光基团修饰上游引物5′端。步骤3、PCR反应体系(15μl)如下：10×BufferI1.5μl，2.5mMdNTP1.2μl，TP-M13(5μM)1μl，特异引物(5μM)1μl，TAKARAHSTaq0.1μl，DNA1.2μl，加ddH2O补齐至15μl。步骤4、PCR反应程序：(1)引物2363,14870,68159，16262,16942,5347的PCR反应程序为95℃5min，94℃30s，56℃30s，35个循环，然后94℃30s，53℃30s，72℃30s，15个循环，最后60℃30min，共50个循环。(2)引物34768，18616,27944,37300,41575，47743，61814的PCR反应程序为95℃5min，94℃30s，58℃降到48℃30s，72℃30s，10个循环，94℃30s，48℃30s，72℃30s，20个循环，95℃30s，53℃30s，72℃30s，10个循环，最后60℃30min，共40个循环。步骤5、电泳检测96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液9μl，PCR产物1.0μl，其中该分子量内标和甲酰胺混合液两者的体积比为0.5：8.5。将PCR产物稀释40倍，在96孔板的各孔中分别加入8.5μl去离子甲酰胺、0.5μlLIZ-500分子量内标和1μl稀释后的PCR产物，95℃变性3min，于4℃放置10min，4000转min-1离心1min，于ABI3730DNA分析仪上进行毛细管电泳。预电泳15kV，3min；2kV电进样10s；电泳15kV；20min。步骤6、数据分析用DataCollection软件收集原始数据，用Genemapper软件分析收集的原始数据，比较各峰值的位置与其泳道中的LIZ-500分子量内标，获得SSR扩增片段的精确分子量bp；将石榴品种的DNA指纹信息编码，再结合品种的形态学特征特性等信息及可能具有的特异基因信息，构建136份不同地区石榴资源品种的身份证，并利用在线条码生成器fhttp://barcode.tecit.combarcodege.nerator.aspx？LANG＝zhcn)和二维码生成软件Encoder2以条码表述构建的石榴品种身份证。本专利技术所述的构建石榴品种身份证的方法在石榴育种过程中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：本专利技术所述方法可简单快速的获得不同石榴品种的片段大小，将上述石榴品种身份证，以条形码或二维码的形式标本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种构建石榴品种身份证的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、在苗期摘取不同石榴品种资源的叶片，用于DNA的提取；步骤2、利用该SSR分子标记引物对，对提取的DNA进行PCR分析；用于石榴品种指纹分析的13对SSR标记引物，由北京阅微生物技术有限公司合成,并分别用FAM蓝色、HEX绿色、TAMRA黄色、ROX红色4种荧光基团修饰上游引物5′端；步骤3、PCR反应体系如下：10×Buffer I 1.5μl，2.5mM dNTP 1.2μl，TP‑M13 1μl，特异引物1μl，TAKARA HS Taq 0.1μl，DNA 1.2μl，加ddH
【技术特征摘要】
1.一种构建石榴品种身份证的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、在苗期摘取不同石榴品种资源的叶片，用于DNA的提取；步骤2、利用该SSR分子标记引物对，对提取的DNA进行PCR分析；用于石榴品种指纹分析的13对SSR标记引物，由北京阅微生物技术有限公司合成,并分别用FAM蓝色、HEX绿色、TAMRA黄色、ROX红色4种荧光基团修饰上游引物5′端；步骤3、PCR反应体系如下：10×BufferI1.5μl，2.5mMdNTP1.2μl，TP-M131μl，特异引物1μl，TAKARAHSTaq0.1μl，DNA1.2μl，加ddH2O补齐至15μl；步骤4、PCR反应程序：(1)引物2363，14870，68159，16262，16942，5347的PCR反应程序为95℃5min，94℃30s，56℃30s，35个循环，然后94℃30s，53℃30s，72℃30s，15个循环，最后60℃30min，共50个循环；(2)引物34768，18616，27944，37300，41575，47743，61814的PCR反应程序为95℃5min，94℃30s，58℃降到48℃30s，72℃30s，10个循环，94℃30s，48℃30s，72℃30s，20个循环，95℃30s，53℃30s，72℃30s，10个循环，最后60℃30min，共40个循环；步骤5、电泳检测96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液9μl，PCR产物1.0μl，其中该分子量内标和甲酰胺混合液两者的体积比为0.5：8.5；将PCR产物稀释40倍，在96孔板的各孔中分别加入8.5μl去离子甲酰胺、0.5μlLIZ-500分子量内标和1μl稀释后的PCR产物，95℃变性3min，于4℃放置10min，4000转min-1离心1min，于ABI3730DNA分析仪上进行毛细管电泳；预电泳15kV，3min；2kV电进样10s；电泳15kV，20min；步骤6、数据分析用DataCollection软件收集原始数据，用Genemapper软件分析收集的原始数据，比较各峰值的位置与其泳道中的LIZ-500分子量内标...
【专利技术属性】
技术研发人员：牛娟，曹尚银，李好先，张杰，陈利娜，刘贝贝，薛辉，
申请(专利权)人：中国农业科学院郑州果树研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41
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