一种快速鉴定分枝杆菌的引物与方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，尤其涉及一种快速鉴定分枝杆菌的引物与方法。本发明专利技术提供的快速鉴定分枝杆菌的引物与方法可以从原始标本出发，通过提取标本中的总的细菌DNA，利用本发明专利技术提供的引物进行PCR扩增，得到Hsp65靶向基因，最后通过靶向测序的途径，对各类型标本中的分枝杆菌进行靶向测序鉴定，可快速、准确地检测出标本中分枝杆菌的菌种类型，具有广泛性和高效性。

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定分枝杆菌的引物与方法
本专利技术属于生物检测
，尤其涉及一种快速鉴定分枝杆菌的引物与方法。
技术介绍
分枝杆菌，包括结核分枝杆菌复合群(MTBC)、麻风分枝杆菌及非结核分枝杆菌(NTM)。NTM和MTBC均可引起肺部及其他部位病变，且临床症状相似，鉴别诊断比较困难。然而，不同分枝杆菌感染引起的疾病其治疗方案是截然不同的，在2012年我国专家达成的共识要求在诊断和治疗前要进行分枝杆菌菌种鉴定，以便能对不同分枝杆菌的感染实施针对性的治疗方案。所以分枝杆菌菌种鉴定对于疾病的诊断、治疗及预后意义重大。据2010年第五次全国结核病流行病学调查，非结核分枝杆菌(NTM)的感染率为22.9％，对人类致病的NTM有20余种。近年来，NTM感染呈增多趋势，严重威胁人类健康。目前分枝杆菌的检测方法主要有以下几种：1)涂片镜检：该方法快速直观，但灵敏度低，重要是只能鉴定到分枝杆菌属，后续仍需做进一步的分枝杆菌菌种鉴定；2)罗氏培养法：检测周期较长，通常约8周时间，灵敏度一般，后续仍需做进一步分枝杆菌菌种鉴定；3)快速培养检测法：检测周期仍较长，但比罗氏培养快，灵敏度较罗氏培养高，但污染率也高，后续需做进一步分枝杆菌菌种鉴定并且需要专用仪器和试剂，价格高；4)分子诊断：目前应用最多的是GeneXpert，该方法时效性很强，可以从痰液标本直接出发，经过两小时得出结果，但是该平台只能做痰液的结核分枝杆菌的诊断，其他非结核分枝杆菌或非痰液标本无法检测；5)γ-干扰素释放试验(IGRA)诊断：该方法只用于结核杆菌的诊断，对于非结核分枝杆菌的诊断无效。中国专利CN102634575B公开了一种分枝杆菌菌种快速鉴定方法及试剂盒，其基本原理为：基于荧光定量PCR技术平台，结合多重不对称PCR技术和熔解曲线技术，并运用多个荧光检测通道在一个PCR反应中检测多种不同荧光标记的探针与扩增产物所形成的熔解峰，利用熔解峰所示的Tm值来鉴定分枝杆菌菌种。但是，部分分枝杆菌菌种的Tm值差别不明显，不能明确区分鉴别，容易造成混淆和错判，该法灵敏度和精确度有待提高。现有技术中仍需要一种可以快速、准确地对各标本中的分枝杆菌进行鉴定且可以直接鉴定到分枝杆菌具体菌种的检测方法。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种快速鉴定分枝杆菌的引物与方法。本专利技术提供的检测方法是从原始标本出发对各类标本中的分枝杆菌进行靶向测序鉴定，得到测序序列后利用BLAST将测序序列与NCBI数据库中的数据进行比对，得出鉴定结果，快速、高效、准确地检测出标本中分枝杆菌的菌种类型。本专利技术提供一种快速鉴定分枝杆菌的引物，所述引物为以分枝杆菌Hsp65基因为靶向基因、基于PCR扩增技术设计的引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为：5’-ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3’(SEQIDNO.1)，下游引物为：5’-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3’(SEQIDNO.2)。本专利技术提供的检测方法中，靶向基因的选择尤其重要，既要保证所选择的靶向基因具有分枝杆菌属的特异性，也要保证其具有分枝杆菌属内不同种间的特异性。本专利技术专利技术人经过大量的试验以及长时间的验证后最终选择了Hsp65基因作为本专利技术检测方法的靶向基因。Hsp65蛋白是分枝杆菌的一个主要免疫反应蛋白抗原，既含有不同分枝杆菌共同的表位，也含有不同分枝杆菌菌种独特的表位，它的编码基因广泛存在于分枝杆菌中，同时，Hsp65基因核苷酸序列的多态性总体上大于16SrRNA基因多态性，具有种的特异性，因此其可以用于对分枝杆菌菌种进行区分。本专利技术专利技术人以Hsp65基因为靶向基因，设计了大量引物，通过引物反应条件的优化和比较，以及通过大量的试验验证，筛选出了一对特异性好的引物。本专利技术提供的快速鉴定分枝杆菌的引物，可以实现分枝杆菌的特异性检测，准确性好。相应地，本专利技术还提供一种快速鉴定分枝杆菌的方法，包括如下步骤：S1、从标本中提取总的细菌DNA；S2、以步骤S1所述的总的细菌DNA为模板DNA，利用本专利技术提供的引物进行PCR扩增，PCR扩增反应条件包括：94℃预变性5min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸10min，结束后4℃保存；S3、通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增效果，并对扩增产物进行纯化；将纯化后的PCR扩增产物进行常规Sanger测序；S4、对Sanger测序法得到的基因序列进行分析和处理，获得检测标本中Hsp65靶向基因的序列，将Hsp65靶向基因的序列在NCBI数据库中进行比对，确定分枝杆菌的菌种类型。优选地，所述步骤S1中的标本选自临床样品，如痰液、支气管肺泡灌洗液、胸膜液、腹膜液、尿液、羊膜水、外周血和组织标本等中的一种。由于某些标本，如组织标本等，若没经过分枝杆菌目标菌的富集，其含有的分枝杆菌量可能比较少且标本量比较少，可能会导致假阴性结果。因此，从标本中提取总的细菌DNA时，一方面可以通过一种比较好的选择性培养基，如分枝杆菌快速变色液体培养基(购于广州凯升生物科技有限公司,货号KS080763)对标本中的分枝杆菌进行短时间的快速增殖；另一方面可以针对各种不同类型标本，设计出不同的DNA提取方法，如针对痰液标本，可以针对性的选用柱式唾液、尿液基因组DNA抽提试剂盒(购于生工生物工程有限公司，货号B518266)对总的细菌DNA进行提取，以便提高DNA提取效率。优选地，所述步骤S2中PCR扩增反应的反应体系为：2×TaqPCRMasterMix12.5μL、模板DNA2μL、上游引物1μL、下游引物1μL和ddH2O8.5μL；所述上游引物和下游引物的浓度为10pmoL/μL。所述2×TaqPCRMasterMix购自天根生化科技有限公司(货号KT201)，2×TaqPCRMasterMix中含有TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂以及稳定剂。本专利技术所鉴定的分枝杆菌包括临床常见的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、、田鼠分枝杆菌(M.microti)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、牛分枝杆菌(M.bovis)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、猿猴分枝杆菌(M.simiae)、胃分枝杆菌(M.gastri)、海分枝杆菌(M.marinum)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、不产色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)、爱知分枝杆菌(M.aichiense)、鸟分枝杆菌(M.avium)、迪氏分枝杆菌(M.diernhoferi)、次要分枝杆菌(M.triviale)、偶然分枝杆菌(M.fortuitum)、土地分枝杆菌(M.terrae)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、龟分枝杆菌龟亚种(M.chelonaesubsp.chelonae)、龟分枝杆菌脓肿亚种(M.chelonaesubsp.abscessus)、施氏分枝本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速鉴定分枝杆菌的引物，其特征在于，所述引物为以分枝杆菌Hsp65基因为靶向基因、基于PCR扩增技术设计的引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为：5’‑ACCAACGATGGTGTGTCCAT‑3’，下游引物为：5’‑CTTGTCGAACCGCATACCCT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定分枝杆菌的引物，其特征在于，所述引物为以分枝杆菌Hsp65基因为靶向基因、基于PCR扩增技术设计的引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为：5’-ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3’，下游引物为：5’-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3’。2.一种快速鉴定分枝杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、从标本中提取总的细菌DNA；S2、以步骤S1所述的总的细菌DNA为模板DNA，利用权利要求1中所述的引物进行PCR扩增，PCR扩增反应条件包括：94℃预变性5min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸10min，结束后4℃保存；S3、通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增效果，并对扩增产物进行纯化；将纯化后的PCR扩增产物进行常规Sanger测序；S4、对Sanger测序法得到的基因序列进行分析和处理，获得检测标本中Hsp65靶向基因的序列，将Hsp65靶向基因的序列在NCBI数据库中进行比对，确定分枝杆菌的菌种类型。3.根据权利要求2所述的快速鉴定分枝杆菌的方法，其特征在于，所述步骤S1中的标本选自痰液、支气管肺泡灌洗液、胸膜液、腹膜液、尿液、羊膜水、外周血和组织标本中的一种。4.根据权利要求2所述的快速鉴定分枝杆菌的方法，其特征在于，所述步骤S2中PCR扩增反应的反应体系为：2×TaqPCRMasterMix12.5μL、模板DNA2μL、上游引物1μL、下游引物1μL和ddH2O8.5μL；所述上游引物和下游引物的浓度为10pmoL/μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：柴海云，张磊，袁海明，
申请(专利权)人：广州金域医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44