一种检测气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法：(1)采集气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA；(3)检测：进行PCR扩增；(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立pEASY-T3-MPB70阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断气溶胶样本中是否含有牛分枝杆菌或/和结核分枝杆菌。本发明专利技术还公开了特异性引物(如SEQIDNO.1、2所示)以及试剂盒(由特异性引物、pEASY-T3-MPB70阳性标准质粒、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH2O组成)。本发明专利技术的方法，既可用于养殖场气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的检测与鉴定，也可用于临床血液、血清、奶样、组织等样本的检测与鉴定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于生物检测领域。
技术介绍
牛分枝杆菌(Mycobacterium,bovis)及结核分枝杆菌(Mycobacterium,tuberculosis)均可引起牛和人等人畜共患的结核病(Tuberculosis, TB),前者以感染牛为主，后者以感染人为主，该病被世界动物卫生组织(OIE)定为B类动物传染病，我国将其列为二类动物疫病。调查表明约10%的人结核病是由牛分枝杆菌引起的，在有结核病奶牛的地区，人的结核病感染率高达75%。全球每年有超过900万的新发结核病病例，近年结核病出现复苏趋势，亚洲和非洲部分国家结核病的发病率和死亡率持续增长。根据卫生部疾病预防控制局2012年统计的数据显示，2012年我国有951508人感染结核病，其中死亡2662人。该病因其易传染，全年均可发生，呈世界性流行，严重危害世界养牛业和人类健康。结核病主要经呼吸道、消化道感染，目前可以确认，人和牛吸入含有结核分枝杆菌与牛分枝杆菌的气溶胶是主要感染方式。在养殖场环境中感染结核病的牛可随咳嗽、喷嚷以及呼出的气体将结核菌排出体外，漂浮在空气中，在其活动的环境中形成气溶胶结核菌的污染，健康人及动物吸入后即可感染，严重危害养殖场环境中的人和动物。目前，还没有应用SYBRGreen I实时突光定量PCR技术开展养殖场环境中气溶胶牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的研究报道。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种采集并快速检测养殖场气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法。本专利技术的方法可以检测养殖场气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌，并且具有简捷快速、灵敏特异、低廉准确，实用性强等优点。利用本专利技术的方法可以对养殖场环境中的牛分枝杆菌与结核分枝杆菌气溶胶流行与传播进行实时监测，为养殖场结核病的防控提供技术支持，也可以开展结核病的流行病学调查，为结核病的科学防控提供理论支撑。针对现有技术中对结核病的研究现状及危害的分析，本专利技术选择牛分枝杆菌与结核分枝杆菌分泌性蛋白MBP70基因所共有的序列设计合成引物，建立SYBRGreen I实时荧光定量PCR,可对养殖场气溶胶中牛分枝杆菌及结核分枝杆菌与其它病原进行区分,并在养殖场中开展结核病的流行病学调查，对养殖场中不同环境中，包括动物饲养舍、运动场、挤奶厅及产房等采集牛分枝杆菌与结核分枝杆菌气溶胶样品，利用SYBRGreen I实时荧光定量PCR检测牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的含量及其分布情况，以期为养殖场人畜共患的结核病传播机制研究提供新的技术手段。本专利技术是通过以下技术方案实现的:—种采集并快速检测养殖场气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法，步骤如下:(I)采集气溶胶样本；进一步地，采集气溶胶样本的方法为:采用国际标准的全玻璃液体冲击式采样器(all-glass-1mpinger,简称AGI),以IOmLpH值7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集养殖场环境中的气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA ；进一步地，提取基因组总DNA的方法为:将采集到的IOmL气溶胶样本在室温下12000r/min离心3min，弃上清液，应用细菌基因组DNA试剂盒(商业化产品，现有技术中的常规试剂盒)提取总DNA，每个样本用50 μ LddH2O溶解；(3)检测:以上述提取的基因组总DNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreen I实时荧光定量PCR，具体如 下:所述试剂盒由特异性引物、pEASY-T3-MPB70阳性标准质粒、SYBRGreen I实时荧光定量PCR试剂(现有技术中已有的常规试剂)和ddH20组成；所述PEASY-T3-MPB70阳性标准质粒是由序列为SEQIDN0.3所示的DNA片段与PEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒，连接方法为所属领域常规技术；所述特异性引物的序列如下:MPB70-F:5/ -TGACCAGCATCCTGACCTACC-3' (SEQIDN0.1 所示)；MPB70-R:5/ -CGGCGTTACCGACCTTGA-3' (SEQIDN0.2 所示)；扩增反应体系为20 μ L，包括 2X SYBRPremixExTaqII 10 μ L，模板 2 μ L，10 μ mol/L的上游引物和下游引物各0.5 μ L，RNaseFreeddH207 μ L。反应条件为:预变性95°C 30s，然后95°C变性5s、60°C退火延伸30s进行40个循环，每个循环结束后采集荧光信号；溶解曲线的条件为95°C 10s、65°C 60s，升温至95°C，最后50°C 30s反应结束。(4)建立标准曲线和溶解曲线:建立PEASY-T3-MPB70阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断:若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有牛分枝杆菌或/和结核分枝杆菌；若溶解曲线为一条直线，贝1J表明气溶胶样本中不含有牛分枝杆菌以及结核分枝杆菌。本专利技术建立的SYBRGreen I实时荧光定量PCR方法，通过倍比稀释质粒标准品进行灵敏度检测，最低浓度为2.19X10°个拷贝/μ L。对牛结核分枝杆菌、结核分枝杆菌、禽分枝杆菌、副结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、螺旋杆菌、绿脓杆菌等制备的模板DNA在建立的检测方法下进行扩增，结果表明仅有牛结核分枝杆菌和结核分枝杆菌有阳性扩增，与其他菌株无交叉反应，特异性强。对3个不同浓度的阳性标准品进行了批内检测和批间检测，计算出批内变异系数和批间变异系数，其批内误差和批间误差均小于5%。批内和批间重复试验Ct值的统计学分析表明:相同稀释度标准质粒Ct值之间差异均不显著(Ρ>0.05)。本专利技术的检测气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法，既可用于养殖场气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的检测与鉴定，也可用于临床血液、血清、奶样、组织等样本的检测与鉴定。本专利技术的方法可用于养殖场环境中临床样本的直接检测，也可用于科学研究等非疾病的诊断。【附图说明】 图1:SYBRGreen I实时荧光定量PCR检测牛分枝杆菌与结核分枝杆菌标准品扩增曲线(荧光定量PCR仪自动生成)，图中，曲线1-7代表4.38X 106-4.38X 10°拷贝数/反应的标准品的扩增曲线，曲线8为阴性对照。图2 =SYBRGreen I实时荧光定量PCR检测牛分枝杆菌与结核分枝杆菌标准曲线(突光定量 PCR 仪自动生成),使用 LightCycler* 480 II GeneScanningSoftwareVersionl.5的AbsQuant/2ndDerivativeMax分析模式分析，结果各点在一直线上，各参数值为Error:0.0216, Efficiency: 1.731, Slope:-4.196，模板同图1。图3 =SYBRGreen I实时荧光定量PCR检测牛分枝杆菌与结核分枝杆菌溶解曲线(荧光定量PCR仪自动生成)，为单一峰，模板同图1。图4 =SYBRGreen I实时荧光定量PCR检测牛分枝杆菌与结核分枝杆菌特异性扩增曲线(荧光定量PCR仪自动生成)，其中，曲线I和2的模板分别为牛结核分枝杆菌和结核分枝杆菌，均为S型曲线；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法，其特征在于：步骤如下： (1)采集气溶胶样本； (2)提取气溶胶样本的基因组总DNA； (3)检测：以上述提取的基因组总DNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，具体如下： 所述试剂盒由特异性引物、pEASY‑T3‑MPB70阳性标准质粒、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH2O组成； 所述pEASY‑T3‑MPB70阳性标准质粒是由序列为SEQIDNO.3所示的DNA片段与pEASY‑T3载体相连接后得到的重组质粒； 所述特异性引物的序列如下： MPB70‑F：5′‑TGACCAGCATCCTGACCTACC‑3′； MPB70‑R：5′‑CGGCGTTACCGACCTTGA‑3′； (4)建立标准曲线和溶解曲线：建立pEASY‑T3‑MPB70阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线； (5)判断：若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有牛分枝杆菌或/和结核分枝杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛分枝杆菌以及结核分枝杆菌。

【技术特征摘要】
1.一种检测气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法，其特征在于:步骤如下: (1)采集气溶胶样本； (2)提取气溶胶样本的基因组总DNA； (3)检测:以上述提取的基因组总DNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenI实时荧光定量PCR，具体如下: 所述试剂盒由特异性引物、PEASY-T3-MPB70阳性标准质粒、SYBRGreen I实时荧光定量PCR试剂和ddH20组成； 所述pEASY-T3-MPB70阳性标准质粒是由序列为SEQIDN0.3所示的DNA片段与PEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒； 所述特异性引物的序列如下:MPB70-F:5/ -TGACCAGCATCCTGACCTACC-3'；MPB70-R:5/ -CGGCGTTACCGACCTTGA-3'； (4)建立标准曲线和溶解曲线:建立pEASY-T3-MPB70阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线； (5)判断:若溶解曲 线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有牛分枝杆菌或/和结核分枝杆菌；若溶解曲线为一条直线，贝1J表明气溶胶样本中不含有牛分枝杆菌以及结核分枝杆菌。2.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法，其特征在于:所述步骤(1)中，采集气溶胶样本的方法为:采用全玻璃液体冲击式采样器，以IOmLpH值7.0的磷酸盐缓冲液为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集气溶胶样本。3.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，提取基因组总DNA的方法为:将采集到的IOmL气溶胶样本在室温下12000r/min离心3min，弃上清液，应用细菌基因组DNA试剂盒提取总DNA，每个样本用50 μ LddH2O 溶解。4.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：何洪彬，赵贵民，王洪梅，
申请(专利权)人：山东省农业科学院奶牛研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37