JAK2的突变分析制造技术

本发明专利技术描述了对JAK2中的突变的测定。所述测定利用使用优先与野生型等位基因杂交的阻断探针进行的突变等位基因的选择性扩增。然后使用相同的探针来检测野生型序列的存在或不存在。不需要预先知晓具体的突变体序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】JAK2的突变分析专利
本专利技术涉及用于分析JAK2基因中的遗传突变并且特别是单核苷酸多态性(SNPs)的方法。本专利技术的各方面还涉及用于分析所述突变的核酸探针和引物。专利技术背景詹纳斯激酶2 (Janus kinase2，通常称作JAK2)是一种已经参与II型细胞因子受体家族(例如干扰素受体)、GM-CSF受体家族(IL-3R、IL-5R和GM-CSF-R)、gpl30受体家族(例如IL-6R)和单链受体(例如Epo-R、Tpo-R, GH-R、PRL-R)的成员的信号传导的人蛋白。JAK2信号传导在蛋白受体的下游激活。JAK2中的突变已经参与真性红细胞增多症(polycythemia vera)、自发性血小板增多(essential thrombocythemia)和其他骨髓增生病症(myeloproliferative disorders)。这种突变是位置617的纟颜氨酸变为苯丙氨酸,该突变似乎使得造血细胞对生长因子(诸如促红细胞生成素和血小板生成素)更敏感。真性红细胞增多症(还称为红细胞增多病(erythremia)或原发性红细胞增多症(primary polycythemia))是一种血液病症,其中骨髓产生过多的红血细胞。其可能还导致过量产生白血细胞和血小板。由于增加的红血细胞，血液变稠，这引起与真性红细胞增多症相关的大部分健康关注。其在老年人中比较常见并且可以是有症状的或无症状的。提供用于诊断真性红细胞增多症的快速而简单的检测是有益的。美国专利7，429，456描述了 JAK2中缬氨酸到苯丙氨酸(V617F)突变的鉴定，并且描述了用于检测该突变存在的测试。US7，429，456的SEQ ID NOl给出了 V617F形式的人JAK2的氨基酸序列，并且US7，429，456的SEQ ID N02给出了编码所述氨基酸序列的核酸序列(基因序列突变称作G1849T);还参考该蛋白的野生型形式，其NCBI登记号为NM004972。该专利中所述的诊断测试利用跨越核酸序列的位置1849的突变的T核苷酸的核酸探针。通过侧连位置1849的区域的PCR扩增，然后通过用包含T1849核苷酸的探针杂交而检测突变的存在。如果存在杂交，则存在突变。备选地，所述PCR引物可以针对突变体序列，从而选择性扩增该突变体形式。JAK2的mRNA序列(SEQ ID N04)在本申请的图1中给出。位置G1849对应于图1的SEQ ID N04的nt2343。所述测定特异性针对特定的突变。提供备选的诊断测试将是有用的。我们同时未决的专利申请GB1100150.0描述了基于突变体序列的优先扩增而检测和分析靶基因中的SNPs的方法。双链DNA的解链温度(Tm)取决于碱基对杂交的程度；当在探针与靶序列之间存在错配时(例如，由于存在SNP)，那么与不存在错配时相比，Tm是不同的。GB1100150.0中所述的方法包括使用针对靶序列的侧连区域的PCR引物与优先与野生型序列或突变体序列杂交的阻断探针的组合。设计该探针，以使其在与要被阻断的序列(例如，野生型序列)结合时具有的Tm低于其在与要被扩增的序列(例如，突变体序列)结合时具有的Tm。扩增在一定温度进行，以使探针与要被阻断的序列结合而不与要被扩增的序列结合，并且因此只有另一种序列被扩增。然后，可以使用相同的探针来检测所扩增的序列的存在，并且检测所扩增的序列与未扩增的序列的相对比例。 本专利技术应用相关方法来检测JAK2中的突变。专利技术概述按照本专利技术的第一方面，提供一种检测在具有至少第一突变体和野生型等位基因的JAK2基因的基因座中不存在野生型等位基因的方法，所述方法包括:a)提供反应混合物，其包含:i)包含代表JAK2基因的至少一部分的核酸的样品；ii)寡核苷酸探针，其与突变体等位基因杂交的解链温度(Tm)低于其与野生型等位基因杂交的解链温度；iii)用于核酸扩增的成对寡核苷酸引物，所述引物与所述样品中的所述核酸在寡核苷酸探针结合位点侧翼的第一和第二位点杂交；其中引物:样品的Tm高于探针:突变体等位基因的Tm;b)保持所述反应混合物在所述探针:突变体等位基因的Tm与所述探针:野生型等位基因的Tm之间 的温度，以使所述探针优先与所述野生型等位基因杂交；c)对所述反应混合物进行热循环扩增，所述扩增包括解链阶段、退火阶段和延伸阶段，其中所述延伸阶段和退火阶段的温度在所述探针:突变体等位基因的Tm与所述探针:野生型等位基因的Tm之间，以使所述探针在这些阶段与野生型等位基因杂交；由此扩增所述突变体等位基因；和d)在等于或低于所述探针:突变体等位基因的Tm的温度检测所述探针与所述样品的杂交；在等于或低于所述探针:野生型等位基因的Tm的更高的温度检测所述探针与所述样品的杂交；并且比较二者；由此检测所述野生型等位基因的存在或不存在。因此，本专利技术允许第一突变体等位基因较第二野生型等位基因优先得到扩增。在扩增过程中作为阻断探针的相同探针可以用在检测阶段。这显著简化了程序。本专利技术的重要特征是所用的探针检测野生型等位基因的存在或不存在；即，如果野生型等位基因存在，其被检测到，而如果不存在，则其不被检测到。任何突变体序列都将被优先扩增，因此，即使突变体相对少见(例如，仅存在于样品中的少数细胞中)，也能够减少野生型序列的相对拷贝数。当存在突变体时，与在较低温度的突变体检测相比，野生型检测将减少。该方法不局限于检测任何具体的突变体等位基因，因此，与依赖于使用对一种突变体等位基因特异性的探针的备选方法相比，所述方法更加灵活。延伸阶段和退火阶段可以合并，原因在于它们可以在相同温度进行。优选地，在步骤a) i)中由所述样品代表的JAK2基因的部分跨越JAK2基因的nt2343(参照图1中给出的SEQ ID N04定义的nt2343)。该突变体等位基因优选是在nt2343的突变。在一个优选的实施方案中，突变体形式是T2343，而野生型是G2343。这对应于V617F突变。然而，本专利技术不限于使用V617F突变。例如，可以设计探针跨越nt2343和足够的另外的核苷酸，以便关于在氨基酸残基618的突变(例如，少见的C618F突变)具有差异性Tm。这对应于核苷酸置换G2347T。由于本专利技术依赖于探针与野生型序列结合和与突变体序列结合之间的差异性Tm，因此所述突变体序列的本性不重要。在优选的实施方案中，探针跨越nt2343。所述探针优选地包含对应野生型残基G2343的核苷酸；针对其的任何错配都将导致较低的Tm。寡核苷酸探针长度优选为至少15、20、25、26、27、28、29、30个核苷酸。特别优选的寡核苷酸探针包含序列TTT AAA TTA TGG AGT ATG TGT CTGTGGAGA (SEQ ID NO:1)，或由序列 TTTAAATTATGGAGT ATG TGT CTG TGG AGA (SEQ ID NO:1)组成。这对应于图1给出的JAK2序列的nt2324至2353 (探针结合区用下划线表示)。引物优选扩增JAK2序列的长度为至少50、60、70、80、90、100个核苷酸的部分。优选的引物包括TCT TTG AAG CAG CAA GTA TGA TGA(SEQ ID N02 ;正义引物)和GCA TTA GA本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测在具有至少第一突变体和野生型等位基因的JAK2基因中的基因座不存在野生型等位基因的方法，所述方法包括：a)提供反应混合物，其包含：i)样品，所述样品包含代表JAK2基因的至少一部分的核酸；ii)寡核苷酸探针，其与突变体等位基因杂交的解链温度(Tm)低于其与野生型等位基因杂交的解链温度；iii)用于核酸扩增的成对寡核苷酸引物，所述引物与所述样品中的所述核酸在寡核苷酸探针结合位点侧翼的第一和第二位点杂交；其中引物：样品的Tm高于探针：突变体等位基因的Tm；b)保持所述反应混合物在所述探针：突变体等位基因的Tm与所述探针：野生型等位基因的Tm之间的温度，以使所述探针优先与所述野生型等位基因杂交；c)对所述反应混合物进行热循环扩增，所述扩增包括解链阶段、退火阶段和延伸阶段，其中所述延伸阶段和退火阶段的温度在所述探针：突变体等位基因的Tm与所述探针：野生型等位基因的Tm之间，以使所述探针在这些阶段与所述野生型等位基因杂交；由此扩增所述突变体等位基因；和d)在等于或低于所述探针：突变体等位基因的Tm的温度检测所述探针与所述样品的杂交；在等于或低于所述探针：野生型等位基因的Tm的更高的温度检测所述探针与所述样品的杂交；并且比较二者；由此检测所述野生型等位基因的存在或不存在。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.09.30 GB 1116876.21.检测在具有至少第一突变体和野生型等位基因的JAK2基因中的基因座不存在野生型等位基因的方法，所述方法包括: a)提供反应混合物，其包含: i)样品，所述样品包含代表JAK2基因的至少一部分的核酸； ii)寡核苷酸探针，其与突变体等位基因杂交的解链温度(Tm)低于其与野生型等位基因杂交的解链温度； iii)用于核酸扩增的成对寡核苷酸引物，所述引物与所述样品中的所述核酸在寡核苷酸探针结合位点侧翼的第一和第二位点杂交；其中引物:样品的Tm高于探针:突变体等位基因的Tm; b)保持所述反应混合物在所述探针:突变体等位基因的Tm与所述探针:野生型等位基因的Tm之间的温度，以使所述探针优先与所述野生型等位基因杂交； c)对所述反应混合物进行热循环扩增，所述扩增包括解链阶段、退火阶段和延伸阶段，其中所述延伸阶段和退火阶段的温度在所述探针:突变体等位基因的Tm与所述探针:野生型等位基因的Tm之间，以使所述探针在这些阶段与所述野生型等位基因杂交；由此扩增所述突变体等位基因；和 d)在等于或低于所述探针:突变体等位基因的Tm的温度检测所述探针与所述样品的杂交；在等于或低于所述探针:野生型等位基因的Tm的更高的温度检测所述探针与所述样品的杂交；并且比较二者；由此检测所述野生型等位基因的存在或不存在。2.权利要求1的方法，其中在步骤a)i)中由所述样品代表的JAK2基因的部分跨越SEQID N04所示的JAK2基因的nt2343。3.权利要求2的方法，其中所述突变体等位基因是在nt2343的突变。4.权利要求3的方法，其中所述突变体形式是T2343，而所述野生型是G2343。5.权利要求2-4中任一项的方法，其中所述探针被设计为跨越nt2343和足够的另外的核苷酸，以能够检测在氨基酸残基618的突变。6.权利要求2-5中任一项的方法，其中所述探针跨越nt2343。7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述寡核苷酸探针长度优选为至少15、20、25、26、27、28、29、30 个核苷酸。8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述寡核苷酸探针包含序列TTTMATTATGGAGTATG TGT CTG TGGAGA (SEQ ID NO:1)，或由序列 ITT AAA TTA T...

【专利技术属性】
技术研发人员：本·科布，
申请(专利权)人：艾皮斯托姆有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB