一种检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法：(1)采集气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA；(3)检测：采用特异性引物和试剂盒进行PCR扩增；(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断气溶胶样本中是否含有布鲁氏杆菌。本发明专利技术还公开了特异性引物(如SEQIDNO.3～9所示)以及试剂盒(由特异性引物、pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH2O组成)。本发明专利技术的方法既可用于养殖场气溶胶中布鲁氏杆菌的检测与鉴定，也可用于临床血液、血清、奶样、组织等样本的检测与鉴定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测及鉴别诊断养殖场气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，属于生物检测领域。
技术介绍
气溶胶(aerosol)是指悬浮在气体中的固体和/或液体微粒与气体载体共同组成的多相体系。根据微粒的成分可以划分为生物气溶胶和化学气溶胶。在气溶胶的体系中，把具有生命的气溶胶粒子和活性粒子以及由有生命活性的机体所释放到空气中的各种质粒统称为生物气溶胶，又称为微生物气溶胶，主要分为细菌气溶胶、病毒气溶胶和真菌气溶胶等，与人类及动物的健康密切相关。养殖场环境中的微生物气溶胶的分布可造成以呼吸道传播性的传染病的暴发与流行，给畜牧业生产和人类健康带来严重危害，尤其是当前集约化、高密度养殖环境下更容易形成微生物气溶胶性的疾病流行。因此，通过监测养殖场环境中气溶胶微生物，可以有效地预警预测传染病的暴发流行。布鲁氏杆菌病(Brucellosis，也称布氏杆菌病)是由布鲁氏杆菌属细菌引起的人、畜共患的常见传染病。布鲁氏杆菌属于兼性胞内寄生的革兰氏阴性短小杆菌，无鞭毛，不形成芽孢，有荚膜，是在严格厌氧条件下不生长的需氧菌，其外膜蛋白、脂多糖等成分是决定其感染力的主要因素。在家畜中以牛种布鲁氏杆菌(B.abortus)、羊种布鲁氏杆菌(B.melitensis)和猪种布鲁氏杆菌(B.suis)最常发生,且可由牛、羊、猪传染给人。本病广泛分布于世界各地，每年4~8月为本病的高发季节，与牛羊繁殖、流产及牛羊肉的消费有关，高危人群是牛羊的 饲养、屠宰、兽医、畜产品加工等从业人员。我国目前在人、畜间仍有发生，给畜牧业和人类的健康带来严重的危害。现有技术中，实验室检测布鲁氏杆菌病原的方法主要有细菌染色、分离培养和核酸检测，核酸检测主要是常规PCR法。目前，尚无常规PCR方法检测养殖场气溶胶中布鲁氏杆菌的研究。SYBRGreen I实时荧光定量PCR可以利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线检测目的基因并进行定量分析，同时结合溶解曲线Tm差异进行鉴别诊断的技术。该技术具有敏感性高、特异性强，重复性好等优点；此外操作简便、价格低廉、结果直观，在临床检测和对疾病进程的研究上具有很高的实用价值。目前，还没有应用SYBRGreen I实时荧光定量PCR技术开展养殖场气溶胶中布鲁氏杆菌的研究报道。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了。本专利技术通过采集养殖场不同环境中布鲁氏杆菌气溶胶样本，提取布鲁氏杆菌基因组DNA，应用SYBRGreen I实时荧光定量PCR技术检测布鲁氏杆菌属细菌，同时根据溶解曲线Tm值的不同对气溶胶中牛种布鲁氏杆菌、羊种布鲁氏杆菌和猪种布鲁氏杆菌进行鉴别诊断。利用本方法可以对养殖场环境中的布鲁氏杆菌气溶胶流行与传播进行实时监测，为养殖场布鲁氏杆菌的防控提供技术支持，也可以开展布鲁氏杆菌病的流行病学调查，为布鲁氏杆菌病的科学防控提供理论支撑。本专利技术是通过以下技术方案实现的:，步骤如下:(I)采集气溶胶样本；进一步地，采集气溶胶样本的方法为:采用国际标准的全玻璃液体冲击式采样器(all-glass-1mpinger,简称AGI),以IOmLpH值7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集养殖场环境中的气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA ；进一步地，提取基因组总DNA的方法为:将采集到的IOmL气溶胶样本在室温下12000r/min离心5min，弃上清液，应用细菌基因组DNA试剂盒(商业化产品，现有技术中的常规试剂盒)提取总DNA ；(3)检测:以上述提取的基因组总DNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreen I实时荧光定量PCR，具体如下:所述试剂盒由特异性引物、pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒、SYBRGreen I实时荧光定量PCR试剂(现有技术中已有的常规试剂)和ddH20组成；所述pEASY- T3-VirB10阳性标准质粒是由序列为SEQIDN0.10所示的DNA片段与PEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒，连接方法为所属领域常规技术；所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对；所述通用型检测引物对的序列如下:VirB10-2-F:5/ -TCTTTGTCGTGGGCTTCATCG-3'，如 SEQIDN0.3 所示；VirB10-2-R:5/ -TGGTCTGCACCATCGTCTTGTC-3'，如 SEQIDN0.4 所示。所述布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对的序列具体如下:牛种布鲁氏杆菌特异性检测引物对:Abortus-F:5/ -GCGGCTTTTCTATCACGGTATTC-3'，如 SEQIDN0.5 所示；Abortus-R:5/ -GACCGCATTCATGGGTTTCG-3'，如 SEQIDN0.6 所示；羊种布鲁氏杆菌特异性检测引物对:Melitensis-F:5/ -AACAAGCGGCACCCCTAAAA-3'，如 SEQIDN0.7 所示；Melitensis-R:5/ -CATGCGCTATGATCTGGTTACG-3'，如 SEQIDN0.8 所示；猪种布鲁氏杆菌特异性检测引物对:Suis-F:5/ -CATGCGCTATGATCTGGTTACG-3'，如 SEQIDN0.8 所示；Suis-R:5' -ACCGGAACATGCAAATGAC-3'，如 SEQIDN0.9 所示。扩增体系为:20 μ L的扩增体系，包括2X SYBRPremixExTaqII 10 μ L，模板2 μ L，10 μ mol/L的上游引物和下游引物各0.5 μ L，RNaseFreeddH207 μ L。扩增条件为:预变性95°C 30s，然后按照95°C变性5s、62°C退火延伸30s进行40个循环，每个循环结束后采集荧光信号；溶解曲线的条件为95°C 10s、65°C 60s，升温至95°C，最后50°C 30s反应结束。(4)建立标准曲线和溶解曲线:建立pEASY-T3_VirB10阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断:当所用特异性引物为通用检测引物对时，若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有布鲁氏杆囷；当所用特异性引物为布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对时，若对应于牛种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有牛种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛种布鲁氏杆菌；若对应于羊种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有羊种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有羊种布鲁氏杆菌；若对应于猪种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有猪种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有猪种布鲁氏杆菌。 布鲁氏杆菌四型分泌系统(TypeIVsecretionsystems, T4SS)是布鲁氏杆菌重要的致病力因子，它由VirBl……VirB12十二个蛋白组成，其中VirBlO蛋白为跨膜通道的组成成分，是T4SS的核心结构组份，是主要本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，其特征在于：步骤如下：(1)采集气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA；(3)检测：以上述提取的基因组总DNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，具体如下：所述试剂盒由特异性引物、pEASY‑T3‑VirB10阳性标准质粒、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH2O组成；所述pEASY‑T3‑VirB10阳性标准质粒是由序列为SEQIDNO.10所示的DNA片段与pEASY‑T3载体相连接后得到的重组质粒；所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对；所述通用型检测引物对的序列如下：VirB10‑2‑F：5′‑TCTTTGTCGTGGGCTTCATCG‑3′；VirB10‑2‑R：5′‑TGGTCTGCACCATCGTCTTGTC‑3′；所述布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对的序列具体如下：牛种布鲁氏杆菌特异性检测引物对：Abortus‑F：5′‑GCGGCTTTTCTATCACGGTATTC‑3′；Abortus‑R：5′‑GACCGCATTCATGGGTTTCG‑3′；羊种布鲁氏杆菌特异性检测引物对：Melitensis‑F：5′‑AACAAGCGGCACCCCTAAAA‑3′；Melitensis‑R：5′‑CATGCGCTATGATCTGGTTACG‑3′；猪种布鲁氏杆菌特异性检测引物对：Suis‑F：5′‑CATGCGCTATGATCTGGTTACG‑3′；Suis‑R：5′‑ACCGGAACATGCAAATGAC‑3′；(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立pEASY‑T3‑VirB10阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断：当所用特异性引物为通用检测引物对时，若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有布鲁氏杆菌；当所用特异性引物为布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对时，若对应于牛种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有牛种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛种布鲁氏杆菌；若对应于羊种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有羊种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有羊种布鲁氏杆菌；若对应于猪种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有猪种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有猪种布鲁氏杆菌。...

【技术特征摘要】
1.一种检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，其特征在于:步骤如下: (1)采集气溶胶样本； (2)提取气溶胶样本的基因组总DNA； (3)检测:以上述提取的基因组总DNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenI实时荧光定量PCR，具体如下: 所述试剂盒由特异性引物、pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒、SYBRGreen I实时荧光定量PCR试剂和ddH20组成； 所述pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒是由序列为SEQIDN0.10所示的DNA片段与PEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒； 所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对； 所述通用型检测引物对的序列如下:VirB10-2-F:5/ -TCTTTGTCGTGGGCTTCATCG-3'；VirB10-2-R:5/ -TGGTCTGCACCATCGTCTTGTC-3'； 所述布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对的序列具体如下: 牛种布鲁氏杆菌特异性检测引物对:Abortus-F:5/ -GCGGCTTTTCTATCACGGTATTC-3'；Abortus-R:5/ -GACCGCATTCATGGGTTTCG-3'； 羊种布鲁氏杆菌特异性检测引物对:Melitensis-F:5/ -AACAAGCGGCACCCCTAAAA-3'；Melitensis-R:5/ -CATGCGCTATGATCTGGTTACG-3'； 猪种布鲁氏杆菌特异性检测引物对:Suis-F:5/ -CATGCGCTATGATCTGGTTACG-3'；Suis-R:5/ -ACCGGAACATGCAAATGAC-3'； (4)建立标准曲线和溶解曲线:建立pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线； (5)判断:当所用特异性引物为通用检测引物对时，若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有布鲁氏杆菌； 当所用特异性引物为布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对时，若对应于牛种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有牛种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛种布鲁氏杆菌； 若对应于羊种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有羊种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有羊种布鲁氏杆菌； 若对应于猪种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有猪种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有猪种布鲁氏杆菌。2.根据权利要求1所述的检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，其特征在于:所述步骤(1)中，采集气溶胶样本的方法为:采用全玻璃液体冲击式采样器，以IOmLpH值.7.0的磷酸盐缓冲液为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集气溶胶样本。3.根据权利要求1所述的检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，提取基因组总DNA的方法为:将采集到的IOmL气溶胶样本在室温下.12000r/min离心5min，弃上清液，应用细菌基因组DNA试剂盒提取总DNA。4.根据权利要求1所述的检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，其特征在于:所述步骤⑶中，PCR的扩增体系为:20μL的...

【专利技术属性】
技术研发人员：何洪彬，赵贵民，王洪梅，
申请(专利权)人：山东省农业科学院奶牛研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37