对少量复杂核酸测序制造技术

本发明专利技术提供了例如用于对少量复杂核酸诸如人基因组测序及用于分析所得的序列信息以降低测序误差并实施单元型定相的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对少量复杂核酸测序对相关申请的交叉引用本申请要求2011年4月14日提交的美国临时专利申请N0.61/517，196的优先权权益，其在此通过提及完整并入。本申请要求2011年8月25日提交的美国临时专利申请N0.61/527，428的优先权权益，其在此通过提及完整并入。本申请要求2011年10月12日提交的美国临时专利申请N0.61/546，516的优先权权益，其在此通过提及完整并入。本申请要求2012年4月13日提交的美国专利申请N0.13/447，087的优先权权益，其在此通过提及完整并入。专利技术背景需要改善的用于分析复杂核酸的技术，例如特别是用于改善序列准确度及用于分析具有经由核酸扩增引入的大量误差的序列的方法。此外，需要改善的用于测定对高等生物体基因组的亲本贡献，即人基因组的单元型定相(phasing)的方法。用于单元型定相的方法，包括计算方法和实验定相综述于Browning and Browning, Nature Reviews Geneticsl2:703—7014，2011。专利技术概述本专利技术提供了用于对少量复杂核酸(如本文中限定的)测序及用于分析所得的序列信息以降低测序误差并实施单元型定相的方法和组合物，等等。作为一个例子，即使在将复杂核酸扩增超过1000倍后，例如以来自5-20个人细胞的基因组DNA开始进行扩增后，也已产生完全测定单元型的高度精确的全基因组序列。依照本专利技术的一个方面，提供了用于对生物体(例如哺乳动物诸如人，无论是单个生物体或包含超过一个个体的群体)的复杂核酸测序的方法，此类方法包括:(a)等分取样复杂核酸的样品以生成多个等分试样，每个等分试样包含一定量的复杂核酸；(b)对来自每个等分试样的所述量的复杂核酸测序以从每个等分试样产生一个或多个读取结果；并(C)装配来自每个等分试样的读取结果，从而产生复杂核酸的装配序列，其在响应率70，75，80，85，90或95%或更大时包含每兆碱基不超过1,0.8, 0.7，0.6，0.5，0.4，0.3，0.2，0.1, 0.08，0.06，0.04或更小的假单核苷酸变体。若复杂核酸是哺乳动物(例如人)基因组，任选地，装配序列具有至少70，75，80, 85，90,或95%或更大的基因组响应率和至少70，75，80，85，90or95%或更大的外显子组响应率。依照一个实施方案，复杂核酸包含至少I千兆碱基。在某些实施方案中，复杂核酸是包含多条不同染色体的基因组。依照本专利技术的一个方面，提供了对生物体的复杂核酸测序的方法，其包括:(a)提供包含Ipg至IOng所述复杂核酸的样品；(b)扩增所述复杂核酸以产生扩增的核酸；并(c)对所述扩增的核酸测序以产生有所述复杂核酸至少70%的响应率的序列。 在本专利技术的一个方面，提供了用于对作为人基因组的复杂核酸测序的方法，其包括(a)等分取样人基因组DNA的样品以产生多个等分试样，每个等分试样包含一定量的所述DNA ;(b)对来自每个等分试样的所述量的所述DNA测序以从每个等分试样产生一个或多个读取结果；(C)装配来自每个等分试样的所述一个或多个读取结果，从而产生第一装配序列；(d)鉴定所述第一装配序列中的多个序列变体；(e)对至少三个所述序列变体定相；并(f)将与所述至少两个其它序列变体的定相不一致的序列变体鉴定为误差，由此生成第二装配序列，由此产生第二装配序列；其中所述第二装配序列在70%或更大的响应率时包含每兆碱基不超过I个假单核苷酸变体。在本专利技术的一个方面，提供了用于对作为人基因组的复杂核酸测序的方法，其包括:(a)等分取样人基因组DNA的样品以产生多个等分试样，每个等分试样包含一定量的所述DNA ； (b)使每个等分试样中的所述量的所述DNA片段化以在每个等分试样中生成DNA片段；(c)用等分试样特异性标签对每个等分试样中的所述DNA片段加标签，通过所述等分试样特异性标签可确定加标签DNA片段起源的等分试样；(d)对来自每个等分试样的加标签DNA片段测序以从每个等分试样产生一个或多个读取结果；并(e)装配来自每个等分试样的所述一个或多个读取结果以产生装配序列，该装配序列在70%或更大的响应率时包含每兆碱基不超过I个假单核苷酸变体，其中所述装配序列的某个位置处的碱基基于来自两个或更多个等分试样的所述位置的初步碱基响应来响应。依照本专利技术的一个方面，提供了用于对作为人基因组的复杂核酸测序的方法，其包括:(a)等分取样人基因组DNA的样品以产生多个等分试样，每个等分试样包含一定量的所述DNA ； (b)使每个等分试样中的所述量的所述DNA片段化以在每个等分试样中生成DNA片段；(c)用等分试样特异性标签对每个等分试样中的所述DNA片段加标签，通过所述等分试样特异性标签可确定加标签DNA片段起源的等分试样；(d)对来自每个等分试样的所述量的所述DNA片段测序以从每个等分试样产生一个或多个读取结果；(e)装配来自每个等分试样的所述一个或多个读取结果以产生第一装配序列；并(f)如下降低所述第一装配序列中的误差以产生第二装配序列:(ii)基于来自两个或更多个等分试样的某个位置的初步碱基响应，响应所述第一装配序列的所述位置处的碱基；并(iii)鉴定所述第一装配序列中的多个序列变体，对 至少三个所述序列变体定相，并将与至少两个其它序列变体的定相不一致的序列变体鉴定为误差；其中所述第二装配序列在70%或更大的响应率时包含每兆碱基不超过I个假单核苷酸变体。依照此类方法的一个实施方案，所述复杂核酸是双链的，所述方法包括在等分取样前分开所述双链复杂核酸的单链。依照另一个实施方案，此类方法包括使每个等分试样中的所述量的所述复杂核酸片段化以生成所述复杂核酸的片段。依照一个实施方案，此类方法进一步包括用等分试样特异性标签(或等分试样特异性标签组)对每个等分试样中的所述复杂核酸的片段加标签，通过所述等分试样特异性标签(或等分试样特异性标签组)可确定加标签片段起源的等分试样。在一个实施方案中，此类标签是多核苷酸，包括例如包含误差校正代码或误差检测代码(包括但不限于Reed-Solomon误差校正代码)的标签。依照另一个实施方案，此类方法包括在测序前合并所述等分试样。在其它实施方案中，不合并等分试样。依照此类方法的另一个实施方案，所述序列包含所述序列的某个位置处的碱基响应，且所述方法包括若所述碱基响应源自两个或更多个等分试样，或源自两个或更多个等分试样的三个或更多个读取结果，则将其鉴定为真的。依照另一个实施方案，此类方法包括鉴定所述装配序列中的多个序列变体，并对所述序列变体定相(phase)。依照此类方法的另一个实施方案，所述复杂核酸的所述样品包含所述生物体的I至20个细胞或自所述细胞分离的基因组DNA，其可以是纯化的或未纯化的。依照另一个实施方案，样品包含Ipg-1OOng,例如约lpg、约6pg、约10pg、约lOOpg、约lng、约IOng或约IOOng基因组DNA、或Ipg至lng、或Ipg至100pg、或6pg至100pg。对于参照目的，单个人细胞含有约6.6pg基因组DNA。依照另一个实施方案，此类方法包括扩增每个等分试样中的所述量的所述复杂核酸。依照此类方法的另一个实施方案，复杂核酸选自下组:基因组、外显子组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对生物体的复杂核酸测序的方法，其包括：(a)等分取样所述复杂核酸的样品以产生多个等分试样，每个等分试样包含一定量的所述复杂核酸；(b)对来自每个等分试样的所述量的所述复杂核酸测序以从每个等分试样产生一个或多个读取结果；并(c)装配来自每个等分试样的所述一个或多个读取结果，从而产生所述复杂核酸的装配序列，该装配序列在70%或更大的响应率(call rate)时包含每兆碱基不超过1个假单核苷酸变体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.04.14 US 61/517,196;2011.08.25 US 61/527,428;1.一种对生物体的复杂核酸测序的方法，其包括: (a)等分取样所述复杂核酸的样品以产生多个等分试样，每个等分试样包含一定量的所述复杂核酸； (b)对来自每个等分试样的所述量的所述复杂核酸测序以从每个等分试样产生一个或多个读取结果；并 (C)装配来自每个等分试样的所述一个或多个读取结果，从而产生所述复杂核酸的装配序列，该装配序列在70%或更大的响应率(call rate)时包含每兆碱基不超过I个假单核苷酸变体。2.权利要求1的方法，其中所述复杂核酸是哺乳动物基因组，并且所述装配序列具有70%或更大的基因组响应率和70%或更大的外显子组响应率。3.权利要求1的方法，其中所述复杂核酸包含至少I千兆碱基。4.权利要求1的方法，其中所述复杂核酸是双链的，所述方法包括在等分取样前将所述复杂核酸双链的各个单链分开。5.权利要求1至4中任一项的方法，其包括使每个等分试样中的所述量的所述复杂核酸片段化以生成所述复杂核酸的片段。6.权利要求5的方法，其包括用等分试样特异性标签对每个等分试样中的所述复杂核酸的片段加标签，从而通过所述等分试样特异性标签可确定加标签的片段的来源等分试样。7.权利要求6的方法，其中所述标签是多核苷酸。8.权利要求7的方法，其中所述标签包含误差校正代码或误差检测代码。9.权利要求8的方法，其中所述标签包含Reed-Solomon误差校正代码。10.权利要求1或权利要求5的方法，其包括在测序前合并所述等分试样。11.权利要求ι-?ο中任一项的方法，其中所述序列包含所述序列的某个位置处的碱基响应，所述方法包括若所述碱基响应源自两个或更多个等分试样，则将其鉴定为真的。12.权利要求1的方法，其中所述生物体是单个生物体。13.权利要求1的方法,其包括鉴定所述装配序列中的多个序列变体,并对所述序列变体定相(phase) ο14.权利要求1的方法，其中所述复杂核酸的所述样品包含所述生物体的I至20个细胞或自所述细胞分离的基因组DNA。15.前述权利要求中任一项的方法，其中所述样品包含Ipg-1Ong复杂核酸。16.前述权利要求中任一项的方法，其包括扩增每个等分试样中的所述量的所述复杂核酸。17.权利要求1的方法，其中所述复杂核酸选自下组:基因组、外显子组、转录物组、甲基化组(methylome)、不同生物体基因组的混合物、一种生物体的不同细胞类型的基因组的混合物，及它们的子集。18.权利要求1的方法，其中所述装配序列具有80x或更小的覆盖。19.哺乳动物的复杂核酸的装配序列，其在70%或更大的响应率时每兆碱基包含少于I个假单核苷酸变体。20.一种对生物体的复杂核酸测序的方法，其包括:(a)提供包含Ipg至IOng所述复杂核酸的样品； (b)扩增所述复杂核酸以产生扩增的核酸； (c)对所述扩增的核酸测序以产生有所述复杂核酸至少70%的响应率的序列。21.权利要求20的方法，其中所述复杂核酸是未纯化的。22.权利要求20的方法，其包括通过多重置换扩增来扩增所述复杂核酸。23.权利要求20的方法，其包括将所述复杂核酸扩增至少1000倍。24.权利要求20-23中任一项的方法，其中所述样品包含I至20个含所述复杂核酸的细胞。25.权利要求24的方法，其包括裂解所述细胞，其中所述细胞包含所述复杂核酸和细胞杂质，并在有所述细胞杂质的情况下扩增所述复杂核酸。26.权利要求24的方法，其中所述细胞是来自高等生物血液的循环非血液细胞。27.权利要求20-26中任一项的方法，其中所述装配序列具有70%的响应率。28.权利要求20的方法，其中所述序列每兆碱基包含两个或更少的假单核苷酸变体。29.权利要求20的方法，其包含: (a)等分取样所述样品以产生多个等分试样，每个等分试样包含一定量的所述复杂核酸； (b)扩增每个等分试样中所述量的复杂核酸以在每个等分试样中生成扩增的核酸； (C)对从每个等分试样扩增的核酸测序以从每个等分试样产生一个或多个读取结果；并 (d)装配所述读取结果以产生所述序列。30.权利要求29的方法，其进一步包括: (e)使每个等分试样中扩增的核酸片段化以生成每个等分试样中所述扩增核酸的片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：R卓马纳克，BA彼得斯，BG科曼尼，
申请(专利权)人：考利达基因组股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US