通过非标记的可逆终止子或天然核苷酸的分步测序制造技术

本发明专利技术提供了用于核酸测序和其他应用的组合物和方法。在通过合成测序中，未标记的可逆终止子在每个循环中通过聚合酶掺入，然后在掺入后通过将直接或间接标记的抗体或其他亲和试剂结合可逆终止子进行标记。

Stepwise sequencing of natural nucleotides or reversible terminators without markers

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过非标记的可逆终止子或天然核苷酸的分步测序相关申请的交叉引用本申请要求2017年1月4日提交的美国临时申请号62/442,263和2017年4月26日提交的美国临时申请号62/490,511的优先权。这些申请的全部内容通过引用并入本文用于所有目的。
技术介绍
对用于核酸测序和重新测序的低成本、高通量的方法的需求已导致开发出“大规模平行测序”(MPS)技术。一种常用的用于DNA测序的方法称为“合成测序”(SBS)，如Ronaghi等人,Science,281:363-365,1998；Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:414-419,2003；Metzker,NatRevGenet.11:31-46,2010；Ju等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:19635–19640,2006；Bentley等人,Nature456:53–59,2008；以及在美国专利号6,210,891、6,828,100、6,833,246和6,911,345以及美国专利公开号2016/0130647中所公开的。SBS需要与被测序的寡核苷酸相对的正确互补核苷酸的受控(即，一次一个)掺入。这允许通过在多个循环中添加核苷酸进行精确测序，因为一次一个地测序每个核苷酸残基，从而防止发生不受控的一系列掺入。在一种途径中，可逆终止子核苷酸(RT)用于确定DNA模板的序列。在最常用的SBS途径中，每个RT包含修饰的核苷酸，其包括(1)阻断基团，所述阻断基团确保通过DNA聚合酶仅将单个碱基添加到生长DNA拷贝链的3'端，以及(2)荧光标签，所述荧光标签能够由相机检测到。在最常见的SBS方法中，将模板和测序引物固定在固体支撑物上，并将该支撑物暴露于四种DNA核苷酸类似物中的每一种，每一种类似物包含通过可裂解接头附着(attach)到含氮碱基的不同荧光团，以及脱氧核糖3'-OH位的3'-O-叠氮基甲基基团，以及DNA聚合酶。只有正确的互补碱基退火到靶，随后在引物的3'末端处掺入。洗掉未掺入的核苷酸，并将固体支撑物成像。引入TCEP(三(2-羧乙基)膦)以裂解接头并释放荧光团并去除3'-O-叠氮基甲基基团，从而使3'-OH再生。然后可以重复该循环((Bentley等人,Nature456,53–59,2008)。对于四种碱基中的每一种使用不同的荧光颜色标记，使得在每个测序循环中，可以通过其颜色鉴定掺入的RT的身份(identity)。尽管SBS被广泛使用，仍然需要改进。例如，目前的SBS方法需要昂贵的可逆终止的dNTP(RT)，其中碱基上的标记(例如染料)与可裂解接头连接，从而导致a)在标记裂解后在掺入的碱基上留下化学疤痕，b)掺入效率较低，c)淬灭，d)激发的染料诱导延伸的终止，以及减少每个测序循环中的信号。
技术实现思路
本专利技术涉及用于核酸分析和测序的方法和组合物。本文公开了一种SBS测序方法，其中通过结合识别最后掺入的核苷酸中的碱基、糖、可裂解的阻断基团或这些组分的组合的亲和试剂(例如，抗体、适体、Affimer、Knottin等)来鉴定最后掺入的核苷酸碱基。结合与可检测信号的产生直接或间接相关联。根据一个实施方案，本专利技术提供了采用非标记的可逆终止子(NLRT)核苷酸来测序的方法。可逆终止子(RT)核苷酸是修饰的脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)或dNTP类似物，其含有可去除的阻断基团，所述阻断基团确保通过DNA聚合酶仅能将单个碱基添加到生长DNA拷贝链的3'端。众所周知，在DNA合成过程中将dNTP(2'-脱氧核苷三磷酸)掺入生长链的3'端涉及焦磷酸酯的释放，以及当dNTP掺入DNA链时，所掺入的部分是单磷酸核苷酸(或更确切地说，通过磷酸二酯键与一个或两个相邻核苷酸单体连接的核苷酸单体)。可逆终止子(RT)核苷酸是修饰的脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)或dNTP类似物，其含有可去除的阻断基团，所述阻断基团确保通过DNA聚合酶仅能将单个碱基添加到生长DNA拷贝链的3'端。非标记的RT核苷酸不含可检测标记。在每个测序循环中，核苷酸或核苷酸类似物通过聚合酶掺入，从而使DNA拷贝链的3'端延伸一个碱基，以及洗掉未掺入的核苷酸或核苷酸类似物。引入亲和试剂，其特异性识别并结合新掺入的核苷酸或核苷酸类似物的表位。在拍摄图像后，从DNA中去除阻断基团和标记的亲和试剂，从而允许开始下一个测序循环。在一些实施方案中，通过亲和试剂识别的表位由掺入的核苷本身(即碱加糖)或核苷和3'阻断基团形成。在一些实施方案中，通过亲和试剂识别的表位由可逆终止子本身、可逆终止子与脱氧核糖组合，或可逆终止子与核碱基或核碱基和脱氧核糖组合形成。根据一个这样的实施方案，本专利技术提供了用于对核酸测序的方法，该方法包括：(a)在引物延伸以将未标记的RT掺入与核酸模板互补的序列的条件下，使包含所述核酸的核酸模板、与所述模板的一部分互补的核酸引物、聚合酶和式I的未标记的RT接触，从而产生包含掺入的RT的未标记的延伸产物：其中：R1是3'-O可逆阻断基团；R2是选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)及其类似物的核碱基；以及R3包含一种或多种磷酸酯(phosphate)或由一种或多种磷酸酯组成；(b)在亲和试剂与所述掺入的RT特异性结合的条件下，使所述未标记的延伸产物与所述亲和试剂接触以产生包含所述RT的标记的延伸产物；(c)检测所述亲和试剂的结合，以及(d)鉴定掺入所述标记的延伸产物中的核苷酸，以鉴定所述延伸产物的序列的至少一部分，并因此鉴定模板核酸的序列的至少一部分。在通常用于通过合成测序的dNTP类似物中，核碱基与可裂解接头缀合，所述接头将碱基连接至可检测标记物，例如荧光团。见，例如，美国专利公开号2002/0227131。相反，在本专利技术的dNTP类似物中，通常R2不是通过接头与染料或其他可检测标记缀合的核碱基。根据另一个实施方案，这种方法进一步包括(d)从所述RT中去除所述可逆阻断基团以产生3'-OH；以及(e)从所述RT中去除所述亲和试剂。根据另一个实施方案，这种方法进一步包括重复该方法的步骤一次或多次，即进行多个测序循环，其中确定所述核酸模板的序列的至少一部分。根据另一个实施方案，这种方法包括在相同反应中去除所述可逆阻断基团和所述亲和试剂。根据另一个实施方案，这种方法包括去除所述亲和试剂而不去除所述可逆阻断基团以及用不同的亲和试剂重新探测。在这种方法中，亲和试剂可包括抗体(包括抗体的结合片段、单链抗体、双特异性抗体等)、适体、Knottin、Affimer或任何其他已知的以合适的特异性和亲和力结合掺入的NLRT的剂。在一个实施方案中，亲和试剂是抗体。在另一个实施方案中，亲和试剂是包含可检测标记的抗体，所述可检测标记是荧光标记。根据一实施方案，R1选自烯丙基、叠氮基甲基、氨基烷氧基、2-氰基乙基、取代的烷基、未取代的烷基、取代的烯基、未取代的烯基、取代的炔基、未取代的炔基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的杂烯基、未取代的杂烯基、取代的杂炔基、未取代的杂炔基、丙二烯基、顺式-氰基乙烯基、反式-氰基乙烯基、顺式-氰基氟代乙烯基、反式-氰基氟代乙烯基、顺式-三氟甲基乙烯基、反式-三氟甲基乙烯基、双氰基乙烯基、双氟代乙烯基、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测3'‑O‑可逆终止子脱氧核糖核苷酸在引物延伸产物的3'端处的掺入的方法，其中所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸包括核碱基、糖单元和可裂解的阻断基团，所述方法包括：(a)将(i)包含掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸的所述引物延伸产物和(ii)与掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸结合的第一亲和试剂组合，其中所述第一亲和试剂与所述核碱基、所述可裂解的阻断基团，或两者结合，以及(b)检测所述第一亲和试剂与掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸的结合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.01.04 US 62/442,263;2017.04.26 US 62/490,5111.一种用于检测3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸在引物延伸产物的3'端处的掺入的方法，其中所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸包括核碱基、糖单元和可裂解的阻断基团，所述方法包括：(a)将(i)包含掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸的所述引物延伸产物和(ii)与掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸结合的第一亲和试剂组合，其中所述第一亲和试剂与所述核碱基、所述可裂解的阻断基团，或两者结合，以及(b)检测所述第一亲和试剂与掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸的结合。2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一亲和试剂结合所述糖单元。3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一亲和试剂结合所述核碱基和所述可裂解的阻断基团。4.如权利要求1所述的方法，其中所述第一亲和试剂结合所述核碱基和所述糖单元。5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述核碱基是选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)的天然核碱基。6.如权利要求5所述的方法，其中所述第一亲和试剂判别：a)包括腺嘌呤(A)的掺入的可逆终止子脱氧核糖核苷酸与包括脱氧核糖核苷酸鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)的掺入的可逆终止子；b)包括G的掺入的可逆终止子脱氧核糖核苷酸与掺入的可逆终止子T、C或A；c)包括T的掺入的可逆终止子脱氧核糖核苷酸与包括G、C或A的掺入的可逆终止子；d)包括C的掺入的可逆终止子脱氧核糖核苷酸与包括脱氧核糖核苷酸鸟嘌呤G、T或A的掺入的可逆终止子。7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述核碱基是核碱基类似物。8.如权利要求7所述的方法，其中所述核碱基是腺嘌呤类似物(A')、鸟嘌呤类似物(G')、胸腺嘧啶类似物(T')或胞嘧啶类似物(C')，以及与结合包括相应天然核碱基的掺入的核苷酸相比，所述第一亲和试剂优先结合包括所述类似物的掺入的核苷酸。9.如权利要求1所述的方法，其中所述第一亲和试剂与所述可裂解的阻断基团结合。10.如权利要求1或权利要求8所述的方法，其中在步骤(d)中，所述引物延伸产物与具有不同结合特异性的2至4种亲和试剂组合，以及一种亲和试剂与掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸结合。11.如权利要求10所述的方法，其中所述一种亲和试剂的所述结合鉴定所述核碱基。12.如前述任一项权利要求所述的方法，进一步包括(d)去除所述可裂解的阻断基团以产生3'-OH脱氧核糖核苷酸。13.一种用于检测3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸在引物延伸产物的3'端处的掺入的方法，其中所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸包含核碱基、糖单元和可裂解的阻断基团，所述方法包括：(a)产生引物延伸产物，其在所述3'端包括3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸；(b)去除掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸的所述可裂解的阻断基团，以产生包括3'-OH单元的3'-OH脱氧核糖核苷酸延伸产物；(c)将来自(b)的所述延伸产物与结合所述3'-OH脱氧核糖核苷酸延伸产物的第一亲和试剂组合，其中所述第一亲和试剂结合所述核碱基和所述3'-OH单元，以及(d)检测所述第一亲和试剂与所述延伸产物的结合。14.如任一项前述权利要求所述的方法，进一步包括(c)去除所述第一亲和试剂。15.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述可裂解的阻断基团选自叠氮基甲基、丙二烯基、顺式-氰基乙烯基、反式-氰基乙烯基、顺式-氰基氟代乙烯基、反式-氰基氟代乙烯基、顺式-三氟甲基乙烯基、反式-三氟甲基乙烯基、双氰基乙烯基、双氟乙烯基、顺式-丙烯基、反式-丙烯基、硝基乙烯基、甲基碳基乙烯基、乙酰基碳基乙烯基、酰氨基乙川、甲基酰氨基乙烯基、二甲基酰氨基乙烯基、甲基磺酰基乙烯基、甲基磺酰基乙基、亚氨酸甲酯、羟肟酸甲酯、乙烯基乙烯基、乙烯代乙烯基、氰基乙烯基、硝基乙烯基、酰氨基乙烯基、3-氧代丁-1-炔基和3-甲氧基-3-氧代丙-1-炔基，或任何前述的类似物。16.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述第一亲和试剂是抗体。17.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述第一亲和试剂与可检测标记缀合或结合，以及在步骤(b)中检测所述亲和试剂与掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸的结合包括检测来自所述可检测标记的信号。18.如权利要求1-16所述的方法，其中所述第一亲和试剂未被标记，以及检测所述第一亲和试剂与掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸的结合的步骤包括(i)将一种或多种二级亲和试剂与所述第一亲和试剂结合，其中所述二级亲和试剂包括可检测标记，以及(ii)检测所述第一亲和试剂与掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸的结合包括检测来自所述可检测标记的信号。19.如权利要求18所述的方法，其中在步骤(a)之前将所述第一亲和试剂和所述第二亲和试剂组合。20.如权利要求18所述的方法，其中所述第一亲和试剂是结合掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸的初级抗体，以及所述一种或多种二级亲和试剂是结合所述初级抗体的一种或多种二级抗体。21.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述可检测标记产生荧光或化学发光信号。22.一种用于进行合成测序反应的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包括多个不同序列的多个固定化模板核酸；(b)使寡核苷酸引物退火到所述模板核酸，其中所述寡核苷酸引物杂交到所述模板核酸上的预定位置；(c)在通过掺入单个可逆终止子脱氧核糖核苷酸延伸多个所述寡核苷酸引物以产生多个引物延伸产物的条件下，将所述模板核酸和退火到所述模板核酸的引物与聚合酶和四种可逆终止子脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)组合，每个脱氧核糖核苷酸包括核碱基(N)、糖单元和可裂解的阻断基团，其中N是腺嘌呤(A)或其类似物(A')、鸟嘌呤(G)或其类似物(G')、胸腺嘧啶(T)或其类似物(T')，以及胞嘧啶(C)或其类似物(C')，其中所述四种dNTP中的至少一种是未标记的，所述引物延伸产物中的一些包括在3'末端处掺入的A或A'，所述引物延伸产物中的一些包括在所述3'末端处掺入的T或T'，所述引物延伸产物中的一些包括在所述3'末端处掺入的G或G'，以及所述引物延伸产物中的一些包括在3'末端处掺入的C或C'；(d)在所述一种或多种第一亲和试剂中的每一种仅与掺入的所述四种可逆终止子脱氧核糖核苷酸中的一种可逆终止子脱氧核糖核苷酸结合的条件下，使所述多个引物延伸产物与一种或多种第一亲和试剂接触，其中所述第一亲和试剂与掺入的四种可逆终止子脱氧核糖核苷酸中的所述一种可逆终止子脱氧核糖核苷酸的所述核碱基、所述糖单元、所述可裂解的阻断基团或其组合结合；(e)检测所述一种或多种第一亲和试剂的所述结合，其中第一亲和试剂与包括掺入的可逆终止子脱氧核糖核苷酸的引物延伸产物的结合鉴定与所述模板核苷酸的核碱基互补的掺入的所述可逆终止的脱氧核糖核苷酸的核碱基，或者与掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸的核碱基互补的所述模板核苷酸的核碱基。23.如权利要求22所述的方法，其中所述dNTP全部都是未标记的。24.如权利要求22或23所述的方法，其中在步骤(d)和(e)中使用两种、三种或四种第一亲和试剂。25.如权利要求22的方法，进一步包括(f)去除所述第一亲和试剂。26.如权利要求22-25的方法，进一步包括(g)去除所述可裂解的阻断基团以产生3'-OH脱氧核糖核苷酸。27.如权利要求26的方法，包括以所需的循环次数重复步骤(c)至(g)以鉴定所述模板中的附加核苷酸，其中步骤(c)中的所述引物是前一循环的引物延伸产物。28.如权利要求27所述的方法，其中所述所需的循环次数为25次或更多次。29.如权利要求22-28所述的方法，其中所述第一亲和试剂是抗体。30.如权利要求22所述的方法，其中四种dNTP是未标记的，以及在步骤(c)中使用四种第一亲和试剂，每种特异性结合掺入的所述四种可逆终止子脱氧核糖核苷酸中的一种。31.如权利要求22-30所述的方法，其中在步骤(c)中，所述第一亲和试剂与可检测标记缀合或结合，以及在步骤(d)中检测所述第一亲和试剂与掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸的结合包括检测来自所述可检测标记的信号。32.如权利要求22所述的方法，其中在步骤(d)中，所述第一亲和试剂未被标记，以及检测所述第一亲和试剂与掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸的结合的步骤包括(i)将一种或多种二级亲和试剂与每种第一亲和试剂结合，其中每种二级亲和试剂包括可检测标记，以及(ii)检测所述第一亲和试剂与掺入的所述可逆终止子脱氧核糖核苷酸的结合包括检测来自所述可检测标记的信号。33.如权利要求32所述的方法，其中所述第一亲和试剂和所述第二亲和试剂是抗体，以及每种第一亲和试剂是结合掺入的可逆终止子脱氧核糖核苷酸的初级抗体，以及每种二级亲和试剂是一个初级抗体的二级抗体。34.如权利要求22-32中任一项所述的方法，其中每种第一亲和试剂与相应掺入的可逆终止子脱氧核糖核苷酸的结合产生可区分的可检测信号。35.如权利要求34所述的方法，其中所述可区分的可检测信号是荧光或化学发光信号。36.如权利要求34-35所述的方法，其中所述可区分的可检测信号通过颜色或强度的差异来区分。37.如权利要求22-36所述的方法，其中所述第一亲和试剂结合所述糖单元。38.如权利要求22-36所述的方法，其中所述第一亲和试剂结合所述核碱基和所述可裂解的阻断基团。39.如权利要求22-36所述的方法，其中所述第一亲和试剂结合所述核碱基和所述糖单元。40.如权利要求22-36中任一项所述的方法，其中所述核碱基是选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)的天然核碱基。41.如权利要求40所述的方法，其中所述第一亲和试剂判别：a)包括腺嘌呤(A)的掺入的可逆终止子脱氧核糖核苷酸与包括脱氧核糖核苷酸鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)的掺入的可逆终止子；b)包括G的掺入的可逆终止子脱氧核糖核苷酸与掺入的可逆终止子T、C或A；c)包括T的掺入的可逆终止子脱氧核糖核苷酸与包括G、C或A的掺入的可逆终止子；d)包括C的掺入的可逆终止子脱氧核糖核苷酸与包括脱氧核糖核苷酸鸟嘌呤G、T或A的掺入的可逆终止子。42.如权利要求22-36中任一项所述的方法，其中所述核碱基是核碱基类似物。43.如权利要求42所述的方法，其中所述核碱基是腺嘌呤类似物(A')、鸟嘌呤类似物(G')、胸腺嘧啶类似物(T')或胞嘧啶类似物(C'...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉多吉·德尔马纳茨，斯尼泽纳·德尔马纳茨，李汉东，徐讯，马修·J·卡洛，利昂·埃克哈特，杨乃波，丁权，
申请(专利权)人：考利达基因组股份有限公司，深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：美国,US