一种针对羊种3型布鲁氏菌感染的DNA疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种分离的DNA片段、针对羊种3型布鲁氏菌感染的DNA疫苗、疫苗制剂、制备DNA疫苗的方法和制备疫苗制剂的方法。本发明专利技术所分离的DNA片段为从羊种3型布鲁氏菌克隆得到的Omp31基因，根据该基因制备的DNA疫苗和疫苗制剂对在我国广泛流行的羊种3型布鲁氏菌具有针对性，并且，该疫苗以及疫苗制剂具有安全无毒、免疫效力强、持续时间长、便于生产和运输等优点。

DNA vaccine for sheep type 3 Brucella infection and preparation method thereof

The present invention provides a separated DNA fragment, a DNA vaccine, a vaccine preparation for the sheep type 3 Brucella infection, a method for preparing a DNA vaccine, and a method for preparing a vaccine formulation. The separation of the DNA fragment of Omp31 gene from Brucella melitensis biovar 3 strains isolated clones, according to the DNA vaccine and the preparation of the gene on the preparation of sheep are widely popular in China 3 Brucella targeted, and the advantages of the vaccine and vaccine preparation is safe without toxicity, immunogenicity, strong long duration, convenient production and transportation etc..

【技术实现步骤摘要】
一种针对羊种3型布鲁氏菌感染的DNA疫苗及其制备方法
本专利技术涉及DNA疫苗领域，具体而言，涉及一种分离的DNA片段、针对羊种3型布鲁氏菌感染的DNA疫苗、疫苗制剂、DNA疫苗的制备方法和疫苗制剂的制备方法。
技术介绍
布鲁氏菌病(Brucellosis)，又称布鲁氏杆菌病，简称布病。布病是由布鲁氏菌属细菌侵入机体后引起传染-变态反应性人畜共患的传染病。人类、家畜及动物普遍易感，人感染主要表现为发热、寒战、盗汗、全身不适等症状，而动物感染的临床症状主要是流产、不孕、生殖器官受侵害。世界动物卫生组织(OIE)已将布病列为B类动物疫病，我国也将其列为二类动物疫病。近年来，布病的人畜疫情在我国和世界其他国家和地区出现回升势头。中国疾病预防控制信息系统的数据表明，2004年以后，我国布病发病率不断上升，至2009年我国人间布病已报告发病35816人。我国每年因布病而产生的治疗费用、误工损失以及对畜牧业造成直接、间接经济损失已经成为一笔天文数字。因此，如何防治布病已经成为当务之急。布病的病原是布鲁氏菌(Brucella)，属于革兰氏阴性菌，无质粒、芽孢和荚膜，兼性寄生于单核巨噬细胞内。该菌产生有毒性的内毒素，内毒素有致热性、致死作用和皮肤过敏原性。病菌主要经呼吸系统、消化系统、生殖系统等进入机体，随淋巴液达淋巴结，被吞噬细胞吞噬。如吞噬细胞未能将细菌杀灭，则细菌在胞内生长繁殖，形成局部原发病灶，随之大量细菌进入淋巴液和血液循环形成菌血症，并随血流带至全身，在肝、脾、淋巴结、骨髓等处的单核-吞噬细胞系统内繁殖，形成多发性病灶。根据宿主差异、生化反应特点及菌体表面的不同结构,可将布鲁氏菌分成6个不同的种,包括羊种布鲁氏菌(B.melitensis)、牛种布鲁氏菌(B.abortus)、猪种布鲁氏菌(B.suis)、绵羊种布鲁氏菌(B.ovis)、沙林鼠种布鲁氏菌(B.neotomae)和犬种布鲁氏菌(B.canis)；其中，羊种布鲁氏菌又包括1型、2型和3型。近年来，我国流行的布鲁氏菌主要是羊种3型布鲁氏菌，该布鲁氏菌对人、畜均有很强的毒力和侵袭力，致病力也很强，人畜感染后症状较严重，容易引起布病的爆发和流行。因此，采取有效措施防治羊种3型布鲁氏菌引起的布病对畜牧业和公共健康事业的发展至关重要。目前，全世界范围内消灭该病的主要方法是扑杀与免疫结合，而在布病发生相对严重的中国，由于扑杀的成本高，疫苗预防成为本病主要控制手段。现有的布鲁氏菌病疫苗主要集中在减毒活疫苗和灭活疫苗，其中，在广泛应用的疫苗主要有减毒活疫苗S19、Rev.1疫苗、羊种布鲁氏菌M5减毒活疫苗。但上述疫苗都属于传统的减毒活疫苗，仍保持一定毒力，容易出现病毒毒力回复，即“返祖现象”，存在安全性的问题。另外，活疫苗须在低温条件下保存及运输，对保存和运输的要求较高。为了克服常规疫苗存在残余毒力等缺陷，科技人员也对布鲁氏菌病DNA疫苗进行研究。DNA疫苗又称基因疫苗或核酸疫苗，是指将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。DNA疫苗具有接种载体(如质粒)结构简单，生产成本低，适于大批量生产、便于运输和保存、比传统疫苗更安全等优点。现有技术中已经成功制备出L7/L12、P39等DNA疫苗，但上述DNA疫苗存在诸多缺陷，例如，pCDNA3-L7/L12刺激的免疫反应只能保持较短的时间(4周)，P39真核疫苗只有较低的保护效力，在攻毒8周后免疫应答的效果才明显(log0.73)，但与传统的S19弱毒疫苗相比，还存在一定差距。总而言之，现有技术缺乏一种安全、稳定、抗体效价高、免疫效力时间长的布鲁氏菌病DNA疫苗，特别是缺少一种针对羊种3型布鲁氏菌感染的DNA疫苗。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种分离的DNA片段，该DNA片段为分离自羊种3型布鲁氏菌的Omp31基因。本专利技术的第二目的在于提供一种针对羊种3型布鲁氏菌感染的DNA疫苗，所述的DNA疫苗针对羊种3型布鲁氏菌的感染，具有安全无毒、免疫效力强、持续时间长、便于运输和保存等优点。本专利技术的第三目的在于提供一种疫苗制剂。本专利技术的第四目的在于提供一种针对羊种3型布鲁氏菌感染的DNA疫苗的制备方法，该制备方法简单易行，便于大规模生产。本专利技术的第五目的在于提供一种疫苗制剂的制备方法。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种分离的DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。本专利技术所述DNA片段为分离自羊种3型布鲁氏菌的Omp31基因，所述Omp31基因编码具有免疫作用的Omp31蛋白。因此，本专利技术所述DNA片段可以用于制备针对羊种3型布鲁氏菌的疫苗。一种针对羊种3型布鲁氏菌感染的DNA疫苗，所述DNA疫苗为包含上述DNA片段的真核表达载体。本专利技术所述DNA疫苗的抗原基因克隆自羊种3型布鲁氏菌的Omp31基因。因此，本专利技术所述DNA疫苗对在我国广泛流行的羊种3型布鲁氏菌具有针对性，有利于防治由羊种3型布鲁氏菌引起的布病。另一方面，本专利技术所述DNA疫苗与传统减毒M5疫苗相比，具有更高的淋巴细胞增殖指数和更强的细胞杀死力。而就抗体表达水平和持续时间而言，本专利技术所述DNA疫苗与减毒M5疫苗的抗体表达水平和抗体持续时间基本相当。因此，本专利技术所述DNA疫苗具有比传统弱毒疫苗更好的免疫效果，具有与传统弱毒疫苗基本相当的抗体效价和持续时间，克服了现有技术中布鲁氏菌DNA疫苗的免疫力弱、效价低、抗体持续时间短的缺陷。如上所述DNA疫苗，优选地，真核表达载体选自pVAX1、pCI、pcDNA3.1和pJW4303。一种疫苗制剂，所述制剂包括上述DNA疫苗和佐剂。如上所述的疫苗制剂，优选地，所述佐剂选自细胞因子基因佐剂和/或载体功能免疫佐剂中的一种或几种。如上所述的疫苗制剂，优选地，所述细胞因子基因佐剂选自IL-2、IL-12、IFN-γ、GM-CSF中的一种或几种，所述载体功能免疫佐剂选自脂质体、免疫刺激复合物(Immunestimulatingcomplexes,ISCOMs)和减毒的侵袭性胞内细菌中的一种或几种。如上所述的疫苗制剂，优选地，所述DNA疫苗和所述佐剂的质量比为1：1-5。本专利技术所述疫苗制剂将DNA疫苗与佐剂配合使用，发现佐剂能够显著增强DNA疫苗的免疫原性从而提高DNA疫苗的免疫效果。尤其是将DNA疫苗的真核表达载体与细胞因子基因佐剂，优选IL12、IL2基因佐剂，配合使用，能够极大地提高本专利技术所述免疫制剂的效果。本专利技术对DNA疫苗和佐剂的用量比进行优化，发现真核表达载体与佐剂的质量比为1：1-5时，本专利技术所述DNA疫苗的免疫效果尤其好。真核表达载体与佐剂的质量比还可以为1:2-4或1:3等。一种制备上述DNA疫苗的方法，所述方法包括：构建包含权利要求1所述DNA片段的真核表达载体。本专利技术所述制备方法主要涉及真核表达载体的构建，不需要直接接触致病菌，操作简单安全，易于大规模生产。如上所述的方法，优选地，所述方法具体包括以下步骤：(1)通过PCR方法扩增得到上述DNA片段；(2)用EcoRⅠ和BamHⅡ分别酶切PCR扩增所得DNA片段和pVAX1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

【技术特征摘要】
1.一种分离的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。2.一种针对羊种3型布鲁氏菌感染的DNA疫苗，其特征在于，所述DNA疫苗为包含权利要求1所述DNA片段的真核表达载体。3.如权利要求2所述的DNA疫苗，其特征在于，所述真核表达载体选自pVAX1、pCI、pcDNA3.1和pJW4303。4.一种疫苗制剂，其特征在于，所述制剂包括权利要求2或3所述DNA疫苗和佐剂。5.如权利要求4所述的疫苗制剂，其特征在于，所述佐剂选自细胞因子基因佐剂和/或载体功能免疫佐剂中的一种或几种。6.如权利要求5所述的疫苗制剂，其特征在于，所述细胞因子基因佐剂选自IL-2、IL-12、IFN-γ、GM-CSF中的一种或几种，所述载体功能免疫佐剂选自脂质体、免疫刺激复合物(Immunestimulating...

【专利技术属性】
技术研发人员：李增魁，
申请(专利权)人：李增魁，
类型：发明
国别省市：青海,63