重组金黄色葡萄球菌ClfA蛋白疫苗及其真核表达工程细胞系的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种重组金黄色葡萄球菌ClfA蛋白疫苗及其真核表达工程细胞系的构建方法，属于生物制药领域。包含金黄色葡萄球菌ClfA基因序列为SEQ ID NO.1所示。构建方法主要步骤为：分离和鉴定金黄色葡萄球菌，提取其基因组DNA。以提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，设计引物扩增ClfA基因序列。将ClfA序列经连接‑T1 Simple Cloning Vector并在DH5α扩增，提取质粒分别对ClfA和pcDNA 3.1 V5‑His B进行双酶切和连接，得到重组质粒ClfA‑pcDNA 3.1 V5‑His B。将连接回收产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并提取重组质粒ClfA‑pcDNA 3.1，借助脂质体2000(lippo2000)转染人乳腺癌细胞MCF‑7，用G‑418筛选阳性细胞克隆和高表达克隆。本发明专利技术能够克服原核生物表达长序列基因编码大分子量蛋白产物时，蛋白产物易于形成包涵体而不易纯化的问题。

Recombinant Staphylococcus aureus ClfA protein vaccine and construction method thereof

The invention discloses a recombinant Staphylococcus aureus ClfA protein vaccine and a method for constructing the eukaryotic expression engineering cell line. The sequence contains ClfA gene of Staphylococcus aureus is shown as SEQ ID NO.1. The main steps of the method are: isolation and identification of Staphylococcus aureus, extraction of genomic DNA. The primers were designed to amplify the ClfA gene sequence using the extracted genomic DNA of Staphylococcus aureus. The ClfA sequence by T1 Simple Cloning connection Vector and amplified in DH5 alpha, ClfA and pcDNA respectively to extract plasmid 3.1 V5 His B double enzyme digestion and ligation, the recombinant plasmid ClfA pcDNA B His V5 3.1. Connect the recovery product transformed into Escherichia coli DH5 alpha, the positive clones were extracted from recombinant plasmid ClfA pcDNA 3.1, 2000 (lippo2000) by liposome transfection of human breast cancer cell line MCF 7, G 418 positive cell clones were cloned and expressed. The invention can overcome the problem that the protein product is easy to form the inclusion body and is not easy to purify when the prokaryotic expression of the long sequence gene encodes the large molecular weight protein product.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制药领域，具体涉及一种重组金黄色葡萄球菌ClfA蛋白疫苗及其真核表达工程细胞系的构建方法。
技术介绍
金黄色葡萄球菌在世界范围内广泛造成人和动物的多种感染，在人类主要引起局部化脓感染、肺炎、肠炎、心包炎等局部或全身感染，它还是导致人类食物中毒的主要病原菌之一；在兽医临床，金黄色葡萄球菌常引起多种动物的乳房炎、渗出性皮炎、尿路感染、脑膜炎、心内膜炎等全身或局部感染。由于临床分离的金黄色葡萄球菌菌株常对多种抗生素具有耐受性，不仅造成临床用药成本的增加，更是出现了耐甲氧西林等多种抗生素的菌株，被称为“超级细菌”。目前，在科研领域虽然有金黄色葡萄球菌疫苗研发相关的报道，但是到目前为止尚没有一项能够广泛应用的高效的重组金黄色葡萄球菌疫苗。尤其是在畜牧养殖领域，集约化饲养模式对高质量疫苗的预防需求大大增加，除了进行环境卫生控制和自家疫苗预防之外，尚没有很好的疫苗产品能够满足这一需求。自家疫苗免疫的最大特点就是针对性强，对于一个独立的养殖场内的病原一般能够取得较好的预防效果；但是分离和纯化细菌菌株，到自家疫苗的制备均需要非常专业的技术人员和专门的生物安全操作环境，而目前国内绝大多数养殖场无法达到这样的标准。从整个生物安全系统和畜牧业发展趋势来看，开发一种高效的、安全的、能够普遍应用于兽医临床的重组基因工程疫苗，对于当代兽医学者来说是一项迫切需要完成的使命任务。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组金黄色葡萄球菌ClfA蛋白疫苗；本专利技术的另一个目的是提供一种真核表达工程细胞系的构建方法，以解决现有的疫苗研发过程中存在部分蛋白产物难以有效表达和纯化的问题。一种重组金黄色葡萄球菌ClfA蛋白疫苗，包含金黄色葡萄球菌ClfA基因序列为SEQIDNO.1所示。优选的，金黄色葡萄球菌ClfA基因所使用的引物如下：上游引物为ClfA-1168F1，序列为GACAAAGCTTAATATGGGCGAAACGAGTG；下游引物ClfA-1168R1，序列为CTCGAGATCAATTTGGATTTGGGAA。一种金黄色葡萄球菌黏附因子ClfA真核表达工程细胞系的构建方法，包括如下步骤：一、根据NCBI在线已发表的金黄色葡萄球菌基因组序列，设计ClfA基因引物；二、以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，提取其基因组DNA，用引物ClfA-1168F1和ClfA-1168R1扩增ClfA基因序列；三、将步骤二中纯化得到的ClfA序列经连接-T1SimpleCloningVector在DH5α扩增后，提取质粒并用HindIII和XhoI分别对ClfA和pcDNA3.1V5-HisB进行双酶切，回收酶切产物并进行连接，得到重组质粒ClfA-pcDNA3.1V5-HisB；四、将步骤三中所述的重组质粒转化大肠杆菌DH5α，通过氨苄青霉素筛选阳性克隆并在具有氨苄筛选压力的LB培养基中进行增殖；五、将步骤四中得到的重组质粒ClfA-pcDNA3.1V5-HisB，借助脂质体2000(lippo2000)转染人乳腺癌细胞MCF-7，并使用G-418筛选阳性细胞克隆和高表达克隆；六、用Ni-NTA亲和层析柱从步骤五中得到的阳性克隆细胞株中纯化重组质粒ClfA-pcDNA3.1V5-HisB的基因蛋白产物，定义为rClfA；七、通过PCR、westernblot技术对步骤五中得到的阳性克隆细胞进行鉴定，确认其具有金黄色葡萄球菌抗原特性；八、用步骤七中得到的纯化后的重组蛋白rClfA免疫Balb/c，检测免疫动物的免疫学指标变化。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤五所涉及的转染细胞系为MCF-7细胞，所使用的转染试剂为脂质体2000，筛选阳性克隆细胞和筛选高表达阳性细胞克隆的过程中所使用的G-418的浓度为800μg/ml。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤二中的金黄色葡萄球菌具有清楚的生物学特性数据：毒力基因检测显示，对hlb、hld、hlg、hlg-2和seb阳性，agr、luks、lukE-lukD、lukM、hla、edin、eta、etb、tst、sea、sec、sec、se、see、seg、she、sei、sej、sej、sen、seo和sem阴性；耐受青霉素、红霉素、四环素、和万古霉素，对氨苄西林、环丙沙星和诺氟沙星敏感。本专利技术将原核生物金黄色葡萄球菌的黏附素基因ClfA在人乳腺癌细胞中成功表达，构建了真核表达工程细胞系。该构建方法能够用于在原核生物中难以有效表达的基因序列的表达及其产物纯化。主要步骤：分离和鉴定金黄色葡萄球菌，提取其基因组DNA。以提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，设计引物扩增ClfA基因序列。将该序列连接克隆载体并在大肠杆菌中扩增，提取质粒进行双酶切，并连接真核表达载体pcDNA3.1V5-HisB，转染人乳腺癌细胞MCF-7，用G-418筛选高表达阳性细胞克隆，将高表达细胞进行增殖并提取总蛋白，用Ni-NTA亲和树脂纯化重组的ClfA蛋白(rClfA)，经与弗氏佐剂乳化后免疫Balb/c小鼠；免疫试验表明，皮下注射时，重组ClfA蛋白能够诱导受试动物产生显著高于对照组动物的免疫球蛋白IgGs，干扰素IFN-γ，白细胞介素IL-1、IL-2和IL-4；而黏膜免疫时能够诱导受试动物产生显著高于对照组动物的分泌性免疫球蛋白SIgA。将连接回收产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并提取重组质粒ClfA-pcDNA3.1，借助脂质体2000(lippo2000)转染人乳腺癌细胞MCF-7，用G-418筛选阳性细胞克隆和高表达克隆。本专利技术用于制备金黄色葡萄球菌等原核生物的基因工程重组疫苗，应用于在原核表达系统中难以有效表达、不易纯化或是不适合用原核表达系统表达的的基因序列的表达或纯化的原核基因序列。重组ClfA蛋白用于预防金黄色葡萄球菌时抗原种类单一，免疫原性强且没有生物安全性威胁的情况；所涉及的真核表达工程细胞系的构建方法，所得产物易于纯化且纯度高，不存在生物安全问题、不存在药物耐受及抗药性风险问题，不存在非特异性免疫，以及不存在毒性返强的可能性。重组金黄色葡萄球菌黏附因子ClfA蛋白疫苗，经过皮下注射免疫Balb/c小鼠，其诱导产生的IgGs、IFN-γ、IL-1、IL-2和IL-4水平，较之PBS对照组，差异极显著；经过黏膜免疫(鼻腔)Balb/c小鼠，其诱导产生的分泌性IgA(肺脏组织)水平，较之PBS对照组，差异极显著；重组蛋白(rClfA)的免疫保护效果优于重组质粒(ClfA-pcDNA3.1V5-HisB)免疫的免疫保护效果。得到的重组蛋白rClfA，保留了与天然金黄色葡萄球菌黏附素相同的抗原特征，能够给免疫动物提供有效的保护。本专利技术所涉及的重组金黄色葡萄球菌疫苗及其真核表达工程细胞系的构建方法，通过对PCR技术筛选后的疫苗靶标基因进行表达和免疫保护试验，设计科学、可行性强。针对金黄色葡萄球菌分布的地区差异特性，筛选多个疫苗靶标，逐一进行免疫保护试验，最终将以多价、多位点疫苗的形式组合出来一种高效的、能够广泛应用于兽医临床的金黄色葡萄球菌疫苗产品，为畜牧业生产提供基础支持。本专利技术以MCF-7作为表达目的基因的工程细胞，其产物经过Ni-NTA亲和层析后，去除了各种杂蛋白，具有抗原特本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组金黄色葡萄球菌ClfA蛋白疫苗，其特征在于：包含金黄色葡萄球菌ClfA基因序列为SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组金黄色葡萄球菌ClfA蛋白疫苗，其特征在于：包含金黄色葡萄球菌ClfA基因序列为SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌ClfA蛋白疫苗，其特征在于：金黄色葡萄球菌ClfA基因所使用的引物如下：上游引物为ClfA-1168F1，序列为GACAAAGCTTAATATGGGCGAAACGAGTG；下游引物ClfA-1168R1，序列为CTCGAGATCAATTTGGATTTGGGAA。3.一种金黄色葡萄球菌黏附因子ClfA真核表达工程细胞系的构建方法，其特征在于包括如下步骤：一、根据NCBI在线已发表的金黄色葡萄球菌基因组序列，设计ClfA基因引物；二、以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，提取其基因组DNA，用引物ClfA-1168F1和ClfA-1168R1扩增ClfA基因序列；三、将步骤二中纯化得到的ClfA序列经连接-T1SimpleCloningVector在DH5α扩增后，提取质粒并用HindIII和XhoI分别对ClfA和pcDNA3.1V5-HisB进行双酶切，回收酶切产物并进行连接，得到重组质粒ClfA-pcDNA3.1V5-HisB；四、将步骤三中所述的重组质粒转化大肠杆菌DH5α，通过氨苄青霉素筛选阳性克隆并在具有氨苄筛选压力的LB培养基中进行增殖；五、将步骤四中得到的重组质粒ClfA-pcDNA3.1V5-HisB，借助脂质体2000(l...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵兴绪，武小虎，张全伟，马友记，张勇，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62