本发明专利技术公开一种植物乳杆菌素plnE和plnF的异源表达方法，从NCBI上查到plnE和plnF的基因序列，序列号为，并在序列的N-端添加肠激酶位点，设计酶切位点Kpn I和Nco I，合成序列；分别质粒pUC57-plnE和pUC57-plnF为模板，设计引物进行plnE和plnF片段的PCR扩增，通过pET-32a质粒和目的片段双酶切后，成功构建重组质粒pET-32a-plnE和pET-32a-plnF，转化至大肠杆菌E. coli DH5α并保存。本发明专利技术利用大肠杆菌异源表达体系，构建表达质粒并实现其在大肠杆菌的高效表达，使得大量制备PlnE/F成为可能，从而为其作用机理研究及其今后在食品领域中的应用提供基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术书属于微生物工程
，具体涉及植物乳杆菌素plnE和plnF的异源表达方法。
技术介绍
化学防腐剂能有效抑制微生物生长，且成本低廉，但过量添加会对人体造成伤害，随着人们对物质水平和饮食健康的需求不断增加，化学防腐剂愈来愈显现出自身的劣势。此外，抗生素的滥用和耐药性等问题的出现，人们开始将目光转向具有安全、高效、无抗药性、无残留和无污染等特点的细菌素上来。近几十年来，研究者已发现数百种乳酸菌细菌素，却仍只有Nisin应用于食品行业，究其原因在于产细菌素的野生菌株产量低且分离困难。由于ClassII的乳酸菌细菌素相比较于Nisin具有抑菌谱广，使得国内外越来越多的研究者致力于ClassII类乳酸菌素的研究开发，包括植物乳杆菌素PlnE和PlnF。然而，天然细菌素所面临的最大挑战是纯化效率极低，近年来，利用异源表达提高细菌素产量的方法越来越受到人们关注，已有多种细菌素实现其在大肠杆菌中的异源表达。植物乳杆菌素PlnE/F具有安全、抗菌活性强、抑菌谱广、热稳定和耐酸等优点，本研究拟通过植物乳杆菌素PlnE/F在大肠杆菌中的异源表达实现其高产，并对其抗菌活性和作用机制进行初步研究，以期为PlnE/F在食品领域中的应用提供理论基础。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种植物乳杆菌素plnE和plnF的异源表达方法，通过探讨其作用机制为以后在食品、医药卫生和饲料等领域的应用提供理论依据。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术的植物乳杆菌素plnE和plnF的异源表达方法，包括下述步骤：(1)从NCBI上查到plnE和plnF的基因序列，在切除前导肽序列后的plnE和plnF基因序列的5'端添加一个肠激酶位点，其基因序列为：5'-GATGATGATGATAAA-3'；根据质粒pET-32a(+)的多克隆位点，选取两个酶切位点KpnI和NcoI，序列分别为5'-GGTACC-3'和5'-CTCGAG-3'，两端最后加入保护碱基，人工合成SEQIDNo.3所示的plnE序列和SEQIDNo.4序列所示的plnF序列；(2)分别以质粒pUC57-plnE和pUC57-plnF为模板，PCR扩增plnE和plnF片段，分别将纯化后的plnE和plnF的PCR产物和pET-32a质粒进行50μL体系双酶切，利用T4连接酶将酶切纯化后的pET-32a(+)线性质粒载体片段分别与PCR酶切回收产物plnE和plnF片段进行连接，得到重组质粒pET-32a-plnE和pET-32a-plnF；(3)重组质粒pET-32a-plnE和pET-32a-plnF转化入大肠杆菌工程菌E.coliBL21(DE3)中，得到工程菌株BL21-pET-32a-plnE和BL21-pET-32a-plnF；(4)分别挑取工程菌BL21-pET-32a-plnE和BL21-pET-32a-plnF单菌落在LB液体培养基中，37℃培养过夜；按2％接种于含50μg/mLAmpr的LB液体培养基中，37℃摇菌培养至OD600达到0.6；加1mMIPTG进行诱导，200rpm的条件下诱导6h。骤(2)中PCR引物如下：plnE-S：5'-CGCGGATCCGGTACCGATGA-3'；plnE-A：5'-CCGCTCGAGTTAACGAATACTTTTCA-3'；plnF-S：5'-CGCGGATCCGGTACCGATGA-3'；plnF-A：5'-CCGCTCGAGCTATCCGTGGA-3'。PCR扩增反应体系为：10×buffer(Mg2+)5μL，2.5mmol/LdNTPMixture5μL，10μmol/L上游引物2.5μL，10μmol/L下游引物2.5μL，模板2.5μL，PrimeSTARHSDNAPolymerase0.5μL，其余为灭菌超纯水，总体积为50μL；plnEPCR扩增反应条件为：95℃预变性10min；进入循环，95℃变性25s，53℃退火25s，72℃延伸25s，30个循环；最后72℃延伸10min，降温至4℃保存；plnFPCR扩增反应条件为：95℃预变性10min；进入循环，95℃变性25s，57.7℃退火25s，72℃延伸25s，30个循环；最后72℃延伸10min，降温至4℃保存。所述plnEPCR产物双酶切反应体系为：10×KBuffer5μL，plnEPCR产物30μL；KpnI2.5μL，NcoI2.5μL，ddH2O10μL，总体积50μL；所述plnFPCR产物双酶切反应体系为：10×KBuffer5μL，plnFPCR产物30μL；KpnI2.5μL，NcoI2.5μL，ddH2O10μL，总体积50μL；所述pET-32a质粒双酶切反应体系为：10×KBuffer5μL，pET-32a质粒25μL；KpnI2.5μL，NcoI2.5μL，ddH2O15μL，总体积50μL。所述plnE和plnF的连接反应体系为：酶切目的片段7μL，酶切质粒1.5μL，10xT4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase0.5μL，总体积10μL。细菌素(Bacteriocins)是一类由细菌核糖体合成，通过在靶细菌细胞膜上形成通道或直接抑制靶细菌细胞内某些功能而高效发挥杀菌作用的抗菌肽或多肽类物质。与传统抗生素相比，细菌素抗菌活性强，不易产生耐药性，且具有无毒副作用、无残留、不污染环境等优点，近年来备受关注并有望成为解决耐药性问题的新一代抗菌剂。目前作用机制明确、允许作为食品添加剂且已商业化的细菌素只有乳酸链球菌素(Nisin)一种，然而抑菌谱较窄及抗性等问题大大降低了Nisin在食品中的应用范围和应用效果。因此，开发新型细菌素作为食品防腐剂或抗菌剂非常必要。与Nisin相比，ClassII细菌素PlnE/F具有抗菌活性强、抑菌谱广、热稳定、耐酸等优点，PlnE/F有望成为新一代食品防腐剂和抑菌剂。为克服天然细菌素所面临的纯化效率极低这一困难，本研究利用大肠杆菌异源表达体系，构建表达质粒并实现其在大肠杆菌的高效表达，使得大量制备PlnE/F成为可能，从而为其作用机理研究及其今后在食品领域中的应用提供基础。附图说明图1pUC57-plnE和pUC57-plnF质粒的提取，注：注：M为Marker，1、2泳道分别为pUC57-plnE和pUC57-plnF质粒。图2合成基因plnE和plnF片段的PCR扩增，注：M为Marker，1、3泳道分别为plnE和plnF合成基因序列的PCR扩增产物，2、4泳道分别为pl本文档来自技高网...
【技术保护点】
植物乳杆菌素plnE和plnF的异源表达方法，其特征在于包括下述步骤：(1)从NCBI上查到plnE和plnF的基因序列，在切除前导肽序列后的plnE和plnF基因序列的5'端添加一个肠激酶位点，其基因序列为：5'‑GATGATGATGATAAA‑3'；根据质粒pET‑32a(+)的多克隆位点，选取两个酶切位点Kpn I和Nco I，序列分别为5'‑GGTACC‑3'和5'‑CTCGAG‑3'，两端最后加入保护碱基，人工合成SEQ ID No.3所示的plnE序列和SEQ ID No.4序列所示的plnF序列；(2)分别以质粒pUC57‑plnE和pUC57‑plnF为模板，PCR扩增plnE和plnF片段，分别将纯化后的plnE和plnF的PCR产物和pET‑32a质粒进行50μL体系双酶切，利用T4连接酶将酶切纯化后的pET‑32a(+)线性质粒载体片段分别与PCR酶切回收产物plnE和plnF片段进行连接，得到重组质粒pET‑32a‑plnE和pET‑32a‑plnF；(3)重组质粒pET‑32a‑plnE和pET‑32a‑plnF转化入大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)中，得到工程菌株BL21‑pET‑32a‑plnE和BL21‑pET‑32a‑plnF；(4)分别挑取工程菌BL21‑pET‑32a‑plnE和BL21‑pET‑32a‑plnF单菌落在LB液体培养基中，37℃培养过夜；按2％接种于含50μg/mL Ampr的LB液体培养基中，37℃摇菌培养至OD600达到0.6；加1mM IPTG进行诱导，200rpm的条件下诱导6h。...
【技术特征摘要】
1.植物乳杆菌素plnE和plnF的异源表达方法，其特征在于包括下述步骤：
(1)从NCBI上查到plnE和plnF的基因序列，在切除前导肽序列后的plnE和plnF基因序
列的5'端添加一个肠激酶位点，其基因序列为：5'-GATGATGATGATAAA-3'；根据质粒pET-32a
(+)的多克隆位点，选取两个酶切位点KpnI和NcoI，序列分别为5'-GGTACC-3'和5'-
CTCGAG-3'，两端最后加入保护碱基，人工合成SEQIDNo.3所示的plnE序列和SEQIDNo.4
序列所示的plnF序列；
(2)分别以质粒pUC57-plnE和pUC57-plnF为模板，PCR扩增plnE和plnF片段，分别将纯
化后的plnE和plnF的PCR产物和pET-32a质粒进行50μL体系双酶切，利用T4连接酶将酶切纯
化后的pET-32a(+)线性质粒载体片段分别与PCR酶切回收产物plnE和plnF片段进行连接，
得到重组质粒pET-32a-plnE和pET-32a-plnF；
(3)重组质粒pET-32a-plnE和pET-32a-plnF转化入大肠杆菌工程菌E.coliBL21(DE3)
中，得到工程菌株BL21-pET-32a-plnE和BL21-pET-32a-plnF；
(4)分别挑取工程菌BL21-pET-32a-plnE和BL21-pET-32a-plnF单菌落在LB液体培养基
中，37℃培养过夜；按2％接种于含50μg/mLAmpr的LB液体培养基中，37℃摇菌培养至OD600
达到0.6；加1mMIPTG进行诱导，200rpm的条件下诱导6h。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌素plnE和plnF的异源表达方法，其特征在于：步骤(2)
中PCR引物如下：
plnE-S：5'-CGCGGATCCGGTACCGATGA-3'；
plnE-A：5'-CCGCTCGAGTTAACGAATACTTTTCA-3'；
plnF-S：5'-CGCGGATCCGGTACCGATGA-3'；...
【专利技术属性】
技术研发人员：郦萍，顾青，吴双双，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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