区分牛病原性和非病原性分枝杆菌感染的试剂盒及方法技术

本发明专利技术属于免疫检测领域。本发明专利技术涉及用于区分牛病原性与非病原性分枝杆菌感染的检测试剂和方法。所述检测试剂包括作为特异性刺激原的重组融合蛋白ｒＥ６－Ｍ６３－Ｈ７０，该重组融合蛋白能够有效刺激体外培养的致敏外周血淋巴细胞高水平释放γ－干扰素（ＩＦＮ－γ）。利用所述检测试剂ｒＥ６－Ｍ６３－Ｈ７０重组融合蛋白作为刺激原建立的牛ＩＦＮ－γ释放试验克服了血清学检测方法和以ＰＰＤ为刺激原的ＩＦＮ－γ释放试验的不足，具有很高的灵敏度和特异性，可区分牛病原性分枝杆菌（如牛分支杆菌）感染和非病原性分支杆菌（如禽分枝杆菌或非致病性分枝杆菌）感染，甚至能区分牛病原性分枝杆菌感染与ＢＣＧ免疫，因此可有效用于临床中牛病原性分枝杆菌的感染的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫检测
本专利技术涉及用于区分牛病原性和非病原性分枝杆菌感染 的试剂盒及方法。技术背景牛结核病是由牛分枝杆菌(Afycofc"cter!'w附6oW力和结核分枝杆菌(j^ycofe"cto7'M附 加&rc"/o^y)引起的一种人畜共患慢性消耗性传染病，人和动物交叉感染造成该病广泛流行， 因此具有非常重要的公共卫生意义。世界卫生组织(WHO)指出"在存在牛结核病的国家，人类始终受到威胁，除非消灭牛结核病，否则人类结核病的控制是不会成功的。"目前， 一些 较发达国家和地区，如美国、澳大利亚和北欧等已基本消灭了牛结核病。但牛结核病在我国 依然是最常见的多发性疾病之一，1985年和1987年两次全国奶牛抽样调查结果显示，牛结 核病的患病率分别达5.83 %和5.43%。近年来，随着个体养牛户的增加，结核病的阳性检出 率正逐年上升。目前我国一些省区牛结核病的发病率已达9%，甚至更高。目前，牛结核病的世界动物卫生组织(OIE)法定检验方法为牛分枝杆菌纯化蛋白衍生 物(purified protein derivatives, PPD)皮内变态反应试验(GB/T 18646)，该试验存在主观性 强、耗时、耗力、短时间内不能进行重复检测、特异性差、近期受感染牛体敏感性很低等方 面的缺点。为了提高牛分枝杆菌检测的特异性，国内外学者开始利用基因重组技术，重组表达了牛 分枝杆菌的多种蛋白，例如，6kDa早期分泌性抗原性靶(The early secreted antigenic target 6ku protein ESAT-6)、 MPB64、 MPB70、 MPB63、热休克蛋白65 (Heat shock protein 65， HSP65)、 抗原85B(antigen 85B, Ag85B)、 10 kDa的培养滤液抗原(10 kDa culture filtrate antigen, CFP10) 等。然后，用这些重组蛋白中的一种或者多种混合(又称"鸡尾酒法")作为包被抗原进行酶 联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测，通过检测牛血清中相应 的抗体水平对牛分枝杆菌感染作出血清学诊断，该方法虽然一定程度上提高了检测的特异性， 但其敏感性不够理想。90年代后期国外发展起来的以PPD为抗原的y干扰素(interferon-y, IFN-7)释放试验明显 提高了牛结核病诊断的灵敏性，其原理为致敏的外周血淋巴细胞在体外培养过程中，通过 特异抗原(如PPD)刺激后被活化，从而高水平表达并分泌IFN-》通过相应的技术手段对培养 上清中IFN-7的释放水平进行检测(如ELISA)从而判断其是否感染，其结果与淋巴细胞增生 试验具有很好的相关性。该方法避免了对机体的侵入性实验，可以短时间内多次重复实验，同时也摒弃了结核菌素试验中操作和判断上的主观性，因此具有非常广泛的应用前景，目前 国外已将该类牛结核病诊断试剂盒商品化。但由于PPD包含的抗原成分复杂，其中部分抗原 在结核分枝杆菌和牛分枝杆菌这类牛病原性分枝杆菌以及禽分枝杆菌与非致病性环境分枝杆 菌等牛非病原性分枝杆菌中均广泛存在，致使其检测特异性较差，同时有研究表明，PPD也 不能有效区分牛分枝杆菌感染和BCG免疫，在实际使用过程中常常出现假阳性。因此，亟需开发一种能同时提高检测的特异性和敏感性的检测试剂和方法，既能克服血 清学检测方法敏感度不高的缺陷，又较PPD刺激IFN-傳放试验具有更高的特异性。本专利技术通过大量实验，用多基因串联重组表达的融合蛋白替代PPD，作为IFN。释放试验 的刺激原，提高了实验特异性的同时，也大大克服了单一抗原或"多抗原鸡尾酒"血清学检测 敏感度不高的缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供用于区分牛病原性和非病原性分支杆菌感染试剂及方法。 本专利技术的目的通过以下技术方案实现体外培养致敏的外周血淋巴细胞，在体外培养过程中用特异抗原刺激将其活化，从而高水平释放IFN-7，然后通过技术手段(如ELISA)检 测培养上清中IFN々，根据IFN-7释放水平的变化，判断是否感染牛分枝杆菌。ESAT-6家族 蛋白是分枝杆菌的一种早期分泌性抗原，主要分布于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中，而卡介 苗(Bacille Calmette-Guerin vaccine, BCG)和大部分非致病性环境分枝杆菌缺失该基因。 ESAT-6具有多个T/B细胞表位，不仅能诱导有效的免疫记忆，而且还能激发免疫记忆细胞早 期高效表达IFN々，这使得通过IFN-7检测进行结核病的早期诊断成为可能。MPB63是结核 分枝杆菌培养滤液中的一种主要分泌蛋白，其表达量在分泌蛋白中居第三位，且与感染结核 分枝杆菌的豚鼠阳性血清产生强烈的免疫反应，是结核分枝杆菌的主要保护性抗原。HSP是 一类在应激状态下诱导产生的高度保守的蛋白质家族，不仅能作为分子伴侣，还能作为危险 信号来诱发机体的免疫应答。在很多抗感染和抗肿瘤免疫反应中，HSP既能活化抗原递呈细 胞(antigen-presenting cell, APC)，诱导细胞因子的释放，也能发挥免疫佐剂和细胞因子样作 用。因此，本专利技术中将ESAT-6、MPB63和HSP70的串联表达的重组融合蛋白(即rE6-M63-H70) 作为特异性刺激原，刺激体外培养致敏的外周血淋巴细胞高水平释放IFN-Y,取得了很好的效 果。一方面，本专利技术提供了一种用于区分牛病原性和非病原性分支杆菌感染的试剂，该试剂 包括用作刺激原的重组融合蛋白，该重组融合蛋白能够有效刺激体外培养的致敏外周血淋巴 细胞高水平释放IFN-7。在本专利技术的具体实施方案中，所述的重组融合蛋白的氨基酸序列包含选自SEQIDN0:2所示的氨基酸序列。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述重组融合蛋白具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基 酸序列。另一方面，本专利技术提供了一种用于区分牛病原性和非病原性分支杆菌感染的方法，该方 法包括下列步骤(a) 使用本专利技术所述的重组融合蛋白作为特异性刺激原，与待检牛抗凝全血共孵育；(b) 孵育后，吸取上层血浆作为待检样品；(c) 检测待检样品中牛IFN-7释放水平，与阴性刺激原的刺激效果进行比较，从而判定 待检牛是否感染了牛分枝杆菌；其中所述的特异性刺激原为一种分离纯化的重组融合蛋白，其氨基酸序列包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在本专利技术的一个实施方案中，使用的ELISA检测待检血浆样品中的牛IFN-7释放水平。 一个具体实施方案中，所述ELISA测定包括下列步骤①用ELISA包被缓冲液将IFN-7单抗 稀释至蛋白质含量为10ng/ml，每孔酶标板加入100 nl， 4'C过夜。次日，弃去孔内溶液，用 洗涤缓冲液(PBST)洗板3次，每次3 min。②每孔酶标板先加入50 nl样品稀释液，再加 入50pl待检样品(同时做空白对照，阴性对照及阳性对照孔)至含有样品稀释液的孔中，混 匀，封板，37'C孵育lh。③用洗涤缓冲液洗板3次，每次3min。④各反应孔中加入100 pl 新鲜配制的辣根过氧化物酶标记兔抗牛二抗，37'C孵育lh。用洗涤缓冲液洗涤3次，每 次3 min本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于牛分枝杆菌感染检测的检测试剂，该试剂包括一种重组表达的融合蛋白，该重组融合蛋白能有效刺激体外培养的致敏外周血淋巴细胞高水平释放ＩＦＮ－γ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱鸿飞，侯绍华，郝辉，贾红，张泉，毛开荣，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]