本发明专利技术涉及一种热应激改变不同部位α受体介导的血管收缩功能促进肾血流的检测方法，该方法使用敏感的离体血管张力描记技术记录大鼠肾动脉、肠系膜动脉、股动脉血管的张力，用实时定量的逆转录聚核酶链反应技术测定动脉平滑肌的mRNA水平研究α受体反应性改变的机制。结果显示热应激后，肾动脉α受体敏感性降低，股动脉α受体敏感性增加，引起血流的重新分配，提示热应激延迟预适应有肾脏保护效应。该方法灵敏度高，结果准确。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
大鼠热应激(Heat stress,HS)指大鼠置于高温环境，使直肠温度升至42°C，持续15分钟。可以诱发机体产生多种内源性物质而起到心血管保护作用，即产生预适应效应，热应激能诱发早期预适应(early preconditioning,EPC)数分钟内出现,持续2-3小时，同时诱发延迟预适应(delayed preconditioning, DPC),预适应后24小时重复保护，持续2-3天[1，2]。热应激可以引起类似于缺血-再灌注的心血管保护效应[3，4]。热应激预适应心脏保护作用表现为热应激后能耐受随后较长时间缺血损伤，减少严重缺血再灌注所引起的心肌梗塞范围，降低心率失常发生率，改善缺血时心肌细胞功能[5’6]。组织器官的功能正常与否与局部血流供应有关，血管的舒缩状态是影响支配组织血流量的重要因素，交感神经系统是体内调节血管张力的重要系统。我们猜测热应激可以改变不同部位血管平滑肌α肾上腺素受体的反应性，从而产生保护重要器官的效应，但未见文献报道。本实验用高灵敏的小血管张力描记技术研究热应激延迟预适应对大鼠肾动脉、肠系膜动脉、股动脉平滑肌α受体介导收缩功能的影响，考察热应激后α受体的反应性，并使用RT-PCR的方法考察热应激对不同部位动脉α !受体mRNA、α 2受体mRNA水平的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的在于使用高灵敏的小血管张力描记技术，提供一种检测热应激延迟预适应对大鼠肾动脉、肠系膜动脉、股动脉平滑肌α受体介导收缩功能的影响的方法。I材料与方法1.1动物与试剂成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF级，体重250~300g,由西安交通大学医学院实验动物中心提供。PowerLab数据记录和分析系统,软件Chart5.0以及硬件8通道桥式放大器(ADInstruments Co, Australia) ;FT03C 张力换能器(Grass InstrumentC0.Quincy, Mass.，U.S.A) ;Myograph恒温浴漕(丹麦DMT);红外线加热室(成都泰盟)；解剖显微镜，型号:SMZ168-TL，麦克奥迪实业集团有限公司。苯肾上腺素(phenyl印hrine，PE),乙酸胆喊(acetylcholine, ACh), 5-轻色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)购于 Sigma公司，浓度以浴槽中最终药物浓度表示。实验中使用分析纯化学试剂，双蒸水。1.2热应激动物模型及动脉环的制备大鼠腹腔内注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉，放入红外线加热的人造环境室(成都泰盟)，大鼠肛温计测量肛温，保持肛温42°C 15分钟，即完成热应激大鼠模型m。对照组同样麻醉，但是没有升温过程，自然苏醒。48小时后，实验大鼠二氧化碳麻醉，断头处死，迅速取出肾动脉、肠系膜动脉、股动脉浸入冷Krebs液(含mmol/L =NaCl119, NaHCO315,KC14.6、MgCl2L 2、NaH2PO4L 2、CaCl2L 5和葡萄糖5.5)中，显微镜下剥离血管周围组织，0.1% Tritonx-1OO血管内灌注10秒，去除血管内皮，再用缓冲液冲洗10秒，当10 μ M乙酰胆碱引起的舒张率< 10%，认为内皮已被去除Μ。将处理好的动脉切成Imm长的圆筒段。实验分组为热应激组、对照组，每组大鼠14只。1.3血管张力记录在显微镜下，将动脉环套在DMT的金属丝上，其中一个连接FT03C?张力换能器，另一个连微调装置(调节负荷张力)，通过软件Chart5.0以及硬件PowerLabS通道桥式放大器，将血管负荷张力显示于屏幕。将安装好的动脉环置入含有5ml Krebs液的370C Myograph恒温浴槽，持续通入含95 % O2和5 % CO2的混合气体，pH保持7.4[8]。实验前，肾动脉环、股动脉环、肠系膜动脉环静息负荷均为2mN，每20分钟换液一次，稳定1.5小时。以K+-Krebs液(含K+63.5mmol/L)检验动脉环收缩性，两次收缩高度大于ImN且收缩幅度相差< 10%者用于实验。K+-Krebs 液组成为(mmol/L:NaC163.5、NaHC0315、KC163.5、MgCl2L 2、NaH2PO4L 2、CaCl2L 5和葡萄糖5.5)。运用累积浓度法在浴槽中加入PE，得到浓度反应曲线。1.4实时定量的逆转录聚核酶链反应技术(RT-PCR)从血管环上分离血管平滑肌，在RNApiV^f Iml中匀浆，制备匀浆液。按照试剂盒说明书，提取总RNA。提取的RNA孵育30分钟(42°C )，完成RNA向cDNA的逆转录过程。RT-PCR在Perkin-Elmer Real-time PCR扩增仪中进行。大鼠α丨受体和α 2受体的特异性引物根据基因数据库 体前引物:5’-CTC CAC TGT GCT GCC CTT C-3’ ；后引物:5’-TGCCAAAGG CCC AGT AGC-3，。α2 受体前引物:5，-TCATTG TCA CTG TGT GGG TCATC-3，;后引物:5’ -TGA GTG GCG GGAAGG AGA-3’。管家基因(ke印ing gene)GAPDH mRNA，在细胞内连续表达使之维持总量恒定，作为mRNA定量的参照。本研究仅以GAPDH作为mRNA定量的参照。GAPDH 前引物:5，-GGC CTT CCG TGT TCC TAC C-3’；后引物:5’ -CGG CAT GTC AGATCCACA AC3’。PCR扩增反应在50 μ I体积中进行，开始在50°C反应2分钟，95 °C反应10分钟，继续95°C反应15秒，60°C反应I分钟，完成40个PCR循环。反应结束后采用分离曲线分析法以确定PCR反应产物的特异性。受体的mRNA定量分析采用PCR循环阈值(Ct)比较法，以GAPDH的Ct值为内对照，计算α:受体和α 2受体的mRNA的相对表达量。1.5统计学分析数据以I ± S表示，收缩反应以激动剂引起收缩效应相对于63.5mmol/L钾引起的收缩效应百分数表达，反应特征表述为Emax (最大收缩百分率)和PD2 (产生一半最大收缩时所需要受体激动剂浓度的负对数)。收缩激动剂的浓度-效应曲线采用迭代最小二乘法契合出的Hill方程(GraphPad Prism4统计软件)估算该激动剂的Emax和pD2值。η =实验中使用的动物数，在同一只大鼠中获得的数据数超过I个值，则取平均值。统计分析及作图使用Prism4.0软件。Students' t检验用来比较两组间的数据，当P < 0.05时被认为有显著性。【具体实施方式】2.1动脉对K+的收缩反应血管平衡好后，K+诱导的收缩在对照组和热应激组的肾动脉、肠系膜动脉、股动脉没有明显差异。2.2内皮去除血管平衡好后，考察内皮去除是否完整，先加入20tM5_HT引起血管收缩，再加入10_5 μ MACh,结果显示在对照组和热应激组肾动脉、肠系膜动脉、股动脉ACh基本不引起血管舒张，认为内皮去除完全。预试验显示20tM5-HT可以引起血管强而稳定的收缩达I小时。2.3热应激后苯肾上腺素对不同部位动脉的收缩反应苯肾上腺素激动本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种热应激改变不同部位α受体介导的血管收缩功能促进肾血流的检测方法，包括使用高灵敏的小血管张力描记。
【技术特征摘要】
1.一种热应激改变不同部位α受体介导的血管收缩功能促进肾血流的检测方法，包括使用高灵敏的小血管张力描记。2.如权利要求1 所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：李洁，林杰，王俊杰，曹永孝，陈碧，
申请(专利权)人：李洁，林杰，王俊杰，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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