自我竞争型引物及运用此自我竞争型引物的方法技术

在此揭示一种自我竞争型引物，其可用以基于样本核酸的选定区域内相较于参考核酸的选定区域是否具有核苷酸变异而优先扩增具有变异的样本核酸。自我竞争型引物包含5’-竞争域与3’-延长域。5’-竞争域与3’-延长域的序列分别和参考核酸的第一与第二区域互补。第一区域包含参考核酸的选定区域以及紧接于选定区域下游的至少一核苷酸残基。第二区域位于选定区域的下游，且不包含该选定区域，第一与第二区域有至少一核苷酸重迭。在此亦揭示于一样本中相对于非变异样本核酸而优先扩增变异样本核酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】在此揭示一种自我竞争型引物，其可用以基于样本核酸的选定区域内相较于参考核酸的选定区域是否具有核苷酸变异而优先扩增具有变异的样本核酸。自我竞争型引物包含5’-竞争域与3’-延长域。5’-竞争域与3’-延长域的序列分别和参考核酸的第一与第二区域互补。第一区域包含参考核酸的选定区域以及紧接于选定区域下游的至少一核苷酸残基。第二区域位于选定区域的下游，且不包含该选定区域，第一与第二区域有至少一核苷酸重迭。在此亦揭示于一样本中相对于非变异样本核酸而优先扩增变异样本核酸的方法。【专利说明】
本专利技术关于用以侦测变异的方法与引物组。具体来说，本专利技术关于一种自我竞争型引物，其可用以优先扩增具有核苷酸变异的样本核酸。
技术介绍
基因突变(gene mutation)指一特定基因或调控序列的核苷酸序列相较于天然(或正常)核苷酸序列有所改变。突变可以是点突变(point mutation ;即，单一核苷酸置换)、一或多个核苷酸的缺失(deletion)或插入(insertion)、多个核苷酸的置换(substitution)或在染色体层级的互换(crossing-over)。在分子遗传学的领域中，辨识基因突变或核苷酸变异非常关键。举例来说，已知有许多基因和癌症的发生和/或进程息息相关，而医学界正尝试针对此类基因发展分子标靶。在进行标靶疗法时，一或多个目的基因的序列变异可能会影响治疗的效果。因此，侦测癌细胞中的一或多个基因突变有助于设计出最适合特定病患的治疗计划。目前已发展出多种可侦测基因突变或核苷酸变异的技术。举例来说，可利用桑格式直接测序法(Sanger’s direct sequencing)来测定目标序列，以得知发生突变的一或多个核苷酸。然而此种直接测序的灵敏度不高，且操作上费时费力，因而限制了此技术在临床与研究领域等的应用。或者是可采用对核苷酸变异序列具有专一性的引物和/或探针，以正向侦测此类变异。传统上，在设 计用以侦测突变的引物或探针时，必须先知道突变部位的序列。以常用来侦测基因突变的对偶基因特异性寡核苷酸聚合酶链反应(allele specificoligonucleotide-polymerase chain reaction,简称 AS0-PCR)为例，需使用对野生型或突变型序列具专一性的引物，并藉由是否可进行扩增反应，来判断是否有突变序列。ASO-PCR的缺点之一在于其专一性通常不高，因而造成较高的假阳性比例。此外，专一性较低时会导致原本不应被扩增的样本核酸被错误地扩增，此时会将引物序列引入至扩增产物中，而使得扩增产物的序列与样本核酸的真实序列不同。样本核酸的错误扩增会使得后续的确认步骤(如测序)失去意义，因为此时的扩增产物无法反映样本核酸的真正序列。此外,在ASO-PCR方法中，一个反应系统中只能利用一种引物，因而一次只能侦测一种序列(野生型或突变型)。因此，当一相同位置可能出现多种核苷酸变异时，必须设计多种引物以确保能涵盖所有的突变序列，且必须进行独立的反应，才能正确地侦测到所有的突变。另一种常用的侦测技术是连接酶链式反应(ligase chain reaction,简称LCR),此技术常和其它以扩增为基础的反应(如PCR)合并使用。LCR采用热稳定的连接酶以及两组引物组，每一引物组包含二个引物，当这两个引物彼此非常靠近时会在连接酶的作用下连接，因而能够用以鉴别单一核苷酸变异(如点突变、单一核苷酸缺失与单一核苷酸插入)。LCR固然有其自身的优点，但无法用以侦测具有多重核苷酸变异的突变序列。更有甚者，当运用于疾病诊断时，由活体组织取得的样本可能同时含有野生型细胞以及突变型细胞。当可想见，野生型细胞的数量通常远高于突变细胞，这可能会影响突变序列的扩增与侦测。有鉴于上述问题，相关领域亟需提出一种能够正确地侦测核苷酸变异的方法，包括单一核苷酸与多核苷酸变异。
技术实现思路

技术实现思路
旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此
技术实现思路
并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在于指出本专利技术实施例的重要/关键组件或界定本专利技术的范围。本专利技术至少部分是基于一种新颖的引物设计方案，此种设计方案使得在扩增过程中，能够优先扩增带有变异序列的核酸(相较于参考核酸)，且因而可用以侦测核苷酸变巳本专利技术的一个方面是关于一种自我竞争型引物，其可用以基于一样本核酸的一选定区域内相较于一参考核酸的一选定区域具有或不具有一核苷酸变异，而优先扩增具有核苷酸变异的该样本核酸。依据本专利技术的一个实施例，所述的自我竞争型引物包含一 5’ -竞争域与一 3’ -延长域。上述5’ -竞争域包含与参考核酸的第一区域互补的一序列，其中上述第一区域包含该参考核酸的选定区域以及紧接于该选定区域下游的至少一个核苷酸残基。所述的3’-延长域包含与参考核酸的第二区域互补的序列，其中上述第二区域位于该参考核酸的该选定区域下游，且不包含该选定区域；此外，上述的第一区域与第二区域有至少一个核苷酸的重迭。所述的3’ -延长域可作为PCR式扩增反应中的正向引物，且能够相对于不具有核苷酸变异的样本核酸(即，非变异样本核酸)而优先扩增具有核苷酸变异的样本核酸(即，变异样本核酸)。根据本专利技术某些实施例，上述自我竞争型引物为非嵌合型引物。在其它替代性实施例中，上述自我竞争型引物为嵌合型引物。在本专利技术多种不同实施方式中，3’ -延长域的最后一个核苷酸与位于参考核酸的选定区域下游1- 37个核苷酸的核苷酸残基互补。根据本专利技术某些实施例，自我竞争型引物的5’-竞争域与3’-延长域可直接或间接透过3’ -5’链接(linkage)或5’ -5’链接而相接。在此二个功能域直接链接的情形中，自我竞争型引物由5’ -竞争域与3’ -延长域所组成。在替代性的实施例中，自我竞争型引物可更包含一核苷链(nucleosidic linker)或非核苷链(non-nucleosidic linker)以连接5’-竞争域与3’-延长域。非核苷链的例示性实施例可为肽、碳水化合物、脂类、脂肪酸、C2 - C18烷基链(alkyl linker)、憐酸根(phosphate group)、憐酸酯(phosphate ester)、亚磷酰胺(phosphoramidite)、聚乙二醇链(poly (ethylene glycol) linker)、乙二醇链、侧链烷基链(branched alkyl linker)、丙三醇(glycerol)或杂环基团(heterocyclic moiety)。本专利技术的一个实施例中使用了 C3间隔物(C3spacer)作为非核苷链。在一个实施例中，自我竞争型引物的5’ -竞争域的序列为GGTAGTTGGAGCTGGTGGCG(SEQ ID N0:SEQ ID NO:1)、3’ -延长域的序列为GAATATAAACTTGTGGTAGTTGG (SEQ ID NO: 2)，且5 ’ -竞争域与3，-延长域由C3间隔物所连接。在另一实施例中，自我竞争型引物的5’ -竞争域的序列为ACCGTGCAGCTCATCACGCAG(SEQ IDN0:8)、3，-延长域的序列为 CTCACCTCCACCGTGCA(SEQ ID NO:9)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种自我竞争型引物，其用以基于相较于一参考核酸的一选定区域，一样本核酸的一选定区域内具有或不具有一核苷酸变异，而优先扩增具有该核苷酸变异的该样本核酸，该自我竞争型引物包含：一5’‑竞争域，包含与该参考核酸的一第一区域互补的一序列，其中该第一区域包含该选定区域与紧接在该参考核酸的该选定区域下游的至少一核苷酸残基；以及一3’‑延长域，包含与该参考核酸的一第二区域互补的一序列，其中该第二区域位于该选定区域的下游且不包含该参考核酸的该选定区域，并且该第一区域与该第二区域彼此重迭至少一核苷酸，且其中该3’‑延长域作为一正向引物，以在该样本核酸的一聚合酶链反应式扩增过程中，相较于不具有该核苷酸变异的该样本核酸而优先扩增具有该核苷酸变异的该样本核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄志凯，陈冀宽，王道远，
申请(专利权)人：黄志凯，陈冀宽，王道远，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71