一种PCR引物设计方法技术

本发明专利技术公开了一种PCR引物设计方法，其包括以下步骤：（1）按照常规方法设计一对PCR引物，其包括一正向引物以及一反向引物；（2）在其中一条引物的5’末端增加一段末端碱基序列，该末端碱基序列的长度至少为6个碱基；（3）在末端碱基序列和常规设计的引物碱基序列之间，插入一垫片序列，所述的垫片序列可以连接两段碱基序列，但不能与脱氧核糖核苷酸碱基（A、C、G、T、U等）配对，可以阻止DNA聚合反应向前进行。本发明专利技术可以简化分子杂交反应过程，还能提高杂交效率进而提高检测信号强度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术、生物化学、生物医药领域，具体地涉及一种用于脱氧核糖核酸(DNA)分子杂交的聚合酶链式反应(PCR)引物设计的方法。本专利技术可用于简化DNA分子杂交，提高DNA分子杂交效果。
技术介绍
PCR是聚合酶链式反应的英文缩写(Polymerase Chain Reaction),是广为人知的技术。PCR反应可以扩增一个DNA片段。PCR技术已经被广泛用于生物学、分子生物学、生物化学、生物医学等学科，已经被广泛用于医学分子诊断。在PCR反应中，基本的反应试剂包括双链DNA模板(待扩增的DNA片段，至少两端的序列必须是已知的)、DNA聚合酶、4种单核苷酸(ATP、CTP、GTP、TTP)、两条位于模板两端的DNA引物、和反应缓冲液。这些试剂以适当的比例混合，放入与DNA引物相适应的温度循环器的环境中，待扩增DNA就会被以指数增加的速度扩增。DNA引物设计就是根据待扩增DNA片段的序列，从待扩增DNA片段的两端挑选出一对可以高效扩增相应区间并符合应用所需的DNA片段，一端一条。这两条引物能与各自相应位置的模板DNA的碱基对配对，即A和T配对，C和G配对。这对引物在PCR反应的条件下，就可以与DNA模板的两端结合，引发反应。引物设计，现在几乎都用引物设计计算机软件来完成，引物设计计算机软件的例子有GeneRunner、Oligo、Primer,等等。将DNA模板序列、以及引物设计的参数要求输入这些软件，软件就会输出PCR引物的序列。专业DNA引物合成公司可以根据序列为客户合成所需引物。DNA探针是指一段DNA片段(经常是单链或者固定之前将它们用不同方法变性为单链)，这段DNA能与需要检测的DNA片段碱基序列在特定的条件下互补结合。当DNA探针被固定在一个介质(比如硝酸纤维素膜、尼龙膜，等等)上时，加入的待检测DNA样品如果含有与探针互补的碱基序列，互补的DNA就可以与探针结合。如果我们把PCR引物在扩增之前用某种标记方法(比如荧光标记、生物素标记，等等)标记，那么就可以在固定探针的点位检测到相应信号。在以PCR和DNA探针组合为基础的分子杂交/分子诊断技术中，DNA探针经常被固定在硝酸纤维素膜或尼龙膜上，标记的引物对待检测的DNA样品模板进行PCR扩增，扩增后的待测样品便被接上可检测的信号，当可检测的样品DNA和探针结合后，便可在探针固定点位检测到相应信号。在以PCR和DNA探针组合为基础的分子杂交/分子诊断技术中，探针DNA的碱基序列，要与待测DNA样品中的某段序列互补。这段样品DNA碱基序列是随着样品DNA的扩增不断被复制，形成双链DNA结构，在与膜上的探针杂交之前，根据PCR产物的退火温度(Tm)计算，需要加热到一定的温度(经常高于产物的退火温度)，使双链DNA变成单链，然后再加入浸泡着点有探针的膜的杂交液中，或者先加入然后一起加热至所需温度(经常高于PCR产物退火温度)。杂交一般在略低于探针退火温度的温度下进行。将PCR产物加热使其从双链变为单链的过程称为DNA变性，经常用摄氏95度使DNA热变性。变性过程涉及到高温，所以这个过程比较麻烦。
技术实现思路
本专利技术主要目的在于提供一种PCR引物设计技术，用于DNA分子杂交，以达到简化分子杂交反应过程的目的。本专利技术的技术方案如下一种PCR引物设计方法，包括以下步骤( I)按照常规方法设计一对PCR引物，其包括一正向引物以及一反向引物；(2)在其中一条引物的5’末端增加一段末端碱基序列，该末端碱基序列的长度至 少为6个碱基；(3)在末端碱基序列和常规设计的引物碱基序列之间，插入一垫片序列，所述的垫片序列可以连接两段碱基序列，但不能与脱氧核糖核苷酸碱基(A、C、G、T、U等)配对，可以阻止DNA聚合反应向前进行。所述的常规方法，即
技术介绍
中所述的、根据待扩增DNA片段的序列，从待扩增DNA片段的两端挑选出一对可以高效扩增相应区间并符合应用所需的DNA片段，一端一条；这两条引物能与各自相应位置的模板DNA的碱基对配对。这对引物在PCR反应的条件下，就可以与DNA模板的两端结合，引发反应。所述的垫片序列包括可以连接两段碱基序列，但不能与A、C、G、T、U等脱氧核糖核苷酸碱基配对的化合物、分子、或其他物质结构。在本专利技术的推荐实施例中，所述的垫片序列，所述的垫片序列，其可以为单个化合物、原子、分子，或为多个化合物、原子、分子连接而成，连接方式例如，相同化合物之间连接，不同化合物之间连接，化合物和分子之间连接，等等。其连接以及长度为能够阻止DNA聚合反应向前进行，而又能保证常规弓I物序列PCR进行即可。在本专利技术的推荐实施例中，所述的垫片序列，其分子包括但不限于C3Spacer, Spacer 9, dSpacer, 3，C6Spacer, Spacerl8, PC Spacer、Spacer 12 等，这些物质的化学结构式分别见附图。在本专利技术的推荐实施例中，末端碱基序列长度为6-200个碱基。更佳地，可以为18-24个碱基。在本专利技术中，末端碱基序列一般要求不能与产物或与(I)中设计的引物形成比较稳定的结构，但这个要求不是必须的。一种PCR引物，其包括如下三部分(I)常规设计的引物序列，(2)在常规设计的引物序列5’末端增加的一段末端碱基序列，该末端碱基序列的长度至少为6个碱基；(3)在末端碱基序列和常规设计的引物碱基序列之间插入的一垫片序列，所述的垫片序列可以连接两段碱基序列，但不能与脱氧核糖核苷酸碱基(A、C、G、T、U等)配对，可以阻止DNA聚合反应向前进行。一种PCR方法，包括如下步骤( I)根据前述的方法设计PCR引物；(2)设计探针，该探针和末端碱基序列互补，长度和末端碱基序列相同或短于末端碱基序列；(3)在未加末端碱基的引物的5’端加一信号标记；(4)扩增，并检测信号。本专利技术的原理如下常规设计的PCR引物，是按如下步骤进行。首先将目标DNA的碱基序列加入PCR弓I物设计软件的界面，再根据要扩增的区域、对引物参数的要求(比如引物长度、退火温度、等等)，输入设计参数。软件便可按照要求筛选出若干对引物。每对引物包含正向(forwand)和反向(reverse)或称上游和下游引物。DNA探针就设在用这对引物扩增的碱基序列区间内并与其中的一段碱基序列互补。本专利技术引物设计是在常规设计的基础上进行改进，在一对引物之一的引物的5’末 端增加一段碱基序列，称之为末端序列，并在增加的末端序列和常规设计的引物碱基序列之间，插入一个或多个不能与A、C、G、T、U等脱氧核糖核苷酸碱基配对的“垫片碱基”。在此称这段增加的序列为“垫片序列”。随后设计的探针与末端序列互补，但是末端序列一般不能与被扩增的这段DNA碱基序列互补形成稳定结构。这样，因为在增加的碱基序列和常规设计的引物碱基序列之间有一个不能配对的“垫片序列”(比如由单个或多个dSpacer、C3Spacer、Spacer9,等等,见图I-图6),在进行DNA扩增时,DNA聚合酶每当合成到这个“垫片序列”时，这条链的这个温度循环的DNA合成就终止，这段增加的末端序列在完成PCR扩增后，产物上的这段碱基序列还是保持单链状态，所以杂交时可以省略高温热变性PCR产物的步骤。而且，因为垫片序列一直是以单链的形式存在，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PCR引物设计方法，包括以下步骤：（1）按照常规方法设计一对PCR引物，其包括一正向引物以及一反向引物；（2）在其中一条引物的5’末端增加一段末端碱基序列，该末端碱基序列的长度至少为6个碱基；（3）在末端碱基序列和常规设计的引物碱基序列之间，插入一垫片序列，所述的垫片序列可以连接两段碱基序列，但不能与脱氧核糖核苷酸碱基配对，可以阻止DNA聚合反应向前进行。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：翁长仁，
申请(专利权)人：龙岩九健生物芯片技术研究所，
类型：发明
国别省市：