一种应用多重PCR阵列技术的核酸检测方法技术

本发明专利技术公开了一种应用多重PCR阵列技术的核酸检测方法。包括：通用标签(UT)序列，通用标签序列与特异性检测引物组成的引物对(5’-UT引物+特异检测引物-3’)，含有该通用标签序列或引物对的试剂盒，及其它们在核酸生物检测中的应用。所述UT序列满足以下条件：①上下游引物的UT序列不同、Tm值相差不超过±1℃，且大于检测引物Tm值5-10℃左右；②UT序列为随机设计的DNA片段，与待检测生物的序列间无同源性。本发明专利技术的检测方法，通过mPCR结合通用标签序列的方法，以提高核酸检测的灵敏度和特异性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种核酸检测方法，特别涉及应用多重PCR阵列技术检测核酸的方法，属于生物

技术介绍
多重PCR技术(multiplex PCR, mPCR)是自上世纪80年代PCR技术诞生以来，该
的又一大革新。传统PCR技术仅使用一对引物，通过扩增产生一个核酸片段，多用于单一目的序列的鉴定。而mPCR是在同一 PCR反应体系里应用两对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与经典的PCR相同。mPCR最大的特点就是提高了检测的效率，使PCR成为了一种高通量的手段(I)高效性，在同一 PCR反应管内同时检出多种待测靶物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一个样本就可检测多种靶标；(2)系统性，mPCR很适宜于成组靶标，如肝炎病毒、肠道致病性细菌、性病、食品微生物及细菌战剂等类别中不同病原体的同时检测；(3)经济性，多种靶标在同一反应体系内同时检出，则在时间、试剂、费用开支等方面的耗费都是很大的节省。mPCR技术在生物医学领域应用广泛。比如多种病原微生物的同时检测或鉴定，某些遗传病及癌基因的分型鉴定等。针对待检对象的多型别，或多位点基因突变等问题，mPCR可提高其检出率。在具体应用中，为了提高检测的特异性，引物的设计与选择则显得尤为重要。同时针对多个基因靶序列进行PCR检测，往往出现为了保证引物的特异性，而使得多对长短不一，GC含量有明显差异的引物间Tm值难以统一的现象，给整个mPCR体系的退火温度程序设置带来困难，从而减低了 mPCR检测的灵敏度。本专利技术针对这一问题，通过mPCR技术结合通用标签序列(universal tag, UT)的方法,即在每条原有检测引物的5’端加上一个自行设计的、Tm值统一的UT引物，使得多对引物在扩增中实现退火温度的统一，提高反应的效率。与此同时，该专利技术还可实现多物种混合样本、多个mPCR体系的同时实施，即mPCR阵列。总而言之，对于普通mPCR而言，本专利技术的主要特点是使得mPCR中多重引物的不同退火温度得以统一，促进了反应的进行，提高检测灵敏度。此外，由于反应体系中UT的Tm值相对普通检测引物偏高，使得PCR的特异性也有所提高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种核酸检测方法，通过mPCR结合UT的方法，以提高核酸检测的灵敏度和特异性。本专利技术的技术方案一种应用mPCR阵列技术的核酸检测方法本专利技术的一个目的是提供通用标签(UT)序列，其由20-24个碱基组成，其特征在于①上下游引物的UT序列不同、Tm值相差不超过±1°C，且大于检测引物Tm值5-10°C左右■级UT序列为随机设计的DNA片段，与待检测生物的核酸序列间无同源性。优选，所述UT序列由多组四个碱基组成的随机四聚体，该四聚体应满足(I)四聚·体间至少要有两个碱基是互不相同的；(2)四聚体之间不能彼此互补；(3)四聚体不应自身配对；(4)四聚体不能由两个重复碱基对组成。更优选，所述UT序列，其由6组随机四聚体组成。进一步优选，所述UT序列由以下6组随机四聚体组成CAGC、GGTA、GACC、ACCT、ATCG、TGCG。进一步优选，UT序列具体是FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCG ；R CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGAC ;和 / 或FGGTAACCTTGCGCAGCATCGGACC ；R AGCCTTGAGGACCTGTAGCCGGAC ;和 / 或 FTGCGCAGCATCGACCTGGTAGACC ；RGGACCTGTAGCCTTGAAGCCGGAC 本专利技术的另一个目的是提供一种引物对，含有上述UT序列以及检测引物对，其中UT序列加在每条检测引物的5’端。优选，引物对是FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGCCTGAATCTTCTGGTAAAAC ；R CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACGTTTCTGGGCTGCCAAACATTAC ；和/或FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGCATTATCACGGTAATTAGTG ；R CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACAGAGCACTGTGCACTTAAG ;和 / 或FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGTAATGCTTTGATCGGCTT ；R:CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACTGGATTGCACTTCATCTTGG。优选，引物对是FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGCAACCGTACAGAATGAAGCGG ；RCTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACTTATTCGTGCAATACTCGTGCG ;和 / 或FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGATTTCTGTAACAGCTACCAACGA ；RCTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACGAATTCCCTGTCTTTTCAAAGTC ；和/ 或FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGGCCCTAATAAATTGGAGGATCTAATGA ；RCTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACGACCAGAAGTTGTATCTTTTTTTCCG。还优选，引物对是FGGTAACCTTGCGCAGCATCGGACCGCTGCGGTAGGTGGTTCAA ；RAGCCTTGAGGACCTGTAGCCGGACTTGTCGCGGATTTGCAACTA 和 / 或FGGTAACCTTGCGCAGCATCGGACCGCTGGCGCCGCTGGCAACAAAATTC ；R AGCCTTGAGGACCTGTAGCCGGACCTTCTGCAGATTGCGGCGTGCCGT ；和/ 或F GGTAACCTTGCGCAGCATCGGACCCGGCTCGTTTATCGGCTT ；RAGCCTTGAGGACCTGTAGCCGGACGGTATTTCGTTTCAGCCAAGCo仍优选，引物对是FTGCGCAGCATCGACCTGGTAGACCGAGTACCAAACTGCTAACACAGGTACTC ；RGGACCTGTAGCCTTGAAGCCGGACAGCTGGTTTGCAGCTTC ;和 / 或F TGCGCAGCATCGACCTGGTAGACCGCTGATTTAAGAGATAGAGGAACA ；RGGACCTGTAGCCTTGAAGCCGGACTTTATGTGGTTATTTGCTGTC ;和 / 或 FTGCGCAGCATCGACCT GGTAGACCT CCGCCTGCAAGTCCTAAG ；R:CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACTGGATTGCACTTCATCTTGG。本专利技术的另一个目的是提供一种试剂盒，其中含有上述UT序列或的引物对。本专利技术的另一个目的是的提供上述UT序列、引物对、试剂盒在非诊断目的的生物检测中的应用。本专利技术的另一个目的是上述UT序列、引物对、试剂盒用于检测鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii),尤其是它的 recA、16S-23S ITS、0XA-51 样基因。本专利技术的另一个目的是上述UT序列、引物对、试剂盒用于检测肺炎链球菌(Streptococc本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种引物对，含有通用标签序列(UT序列)，以及检测引物对，且UT序列加在每条检测引物的5’端；其中，所述UT序列由20？24个碱基组成，并满足以下条件：①上下游引物的UT序列不同、Tm值相差不超过±1℃，且大于检测引物Tm值5？10℃左右；②UT序列为随机设计的DNA片段，与待检测生物的核酸序列间无同源性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杜蓬，张磊，邵世和，孙爱华，王黎芳，周海鸥，银国利，何方，蒋锦琴，花扣珍，覃江凤，
申请(专利权)人：浙江医学高等专科学校，
类型：发明
国别省市：