一种用于鉴定AGA926-928突变的ARMS-qPCR的引物组合及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴定AGA926‑928突变的ARMS‑qPCR的引物组、引物探针组合、PCR试剂、PCR试剂盒及其检测方法；本发明专利技术通过选取幽门螺杆菌16S rDNA基因为靶基因，设计了各种特异性的引物和探针序列，通过组合可检测16S rDNA基因AGA926‑928突变情况；本发明专利技术方法具有特异性强、敏感性高、样品需求量小、操作简单快速、分型准确和结果易判读等优势，可用于临床上幽门螺杆菌16S rDNA基因AGA926‑928突变的检测，为HP感染的个体叫化根除治疗提供用药指导。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学分子生物学领域，具体涉及幽门螺幽杆菌16SrDNA是否存在AGA926-928突变的ARMS-qPCR的引物组、引物探针组合、PCR试剂、PCR试剂盒及其检测方法。
技术介绍
据统计全世界人群中幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori，Hp)感染率达50％，我国的感染率高达60％-90％。幽门螺旋杆菌感染可导致慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃黏膜相关淋巴组织组织(mucosa-associatedlymphoidtissuelymphoma，MALT)淋巴瘤。另外，Hp感染还是心血管疾病、不明原因的缺铁性贫血和慢性特发性血小板减少性紫癜的独立危险因素。因此，对于这类疾病的患者，根除幽门螺旋杆菌至关重要。根除幽门螺旋杆菌治疗的研究一直是幽门螺旋杆菌研究领域中的热点。依照国内外多个版本的幽门螺旋杆菌防治指南意见(1999年海南、2003年庐山、2005年美国胃肠病学会、2007年桐城、2009年欧洲Maastricht-III)，目前质子泵抑制剂(PPI)或铋剂联合两种抗生素的三联疗法是全球推荐的幽门螺旋杆菌根除治疗一线方案，常用的抗生素主要有四环素、阿莫西林、喹诺酮、呋喃唑酮、甲硝唑、四环素等。随着根除幽门螺旋杆菌治疗在临床上的广泛应用，根除的难度逐渐增加，治疗失败的例数亦越来越多，由最初的大于90％的根除率到近期的70％左右甚至有些低于60％。其根除治疗失败的原因较多，包括宿主因素：依从性、机体免疫、胃内PH、吸烟状况；细菌因素：幽门螺旋杆菌菌株、定植、密度、球形变；环境因素(再感染)；治疗方案(包括用药时间及方法)；抗生素耐药。其中幽门螺旋杆菌对抗生素耐药是一线三联根除治疗失败最主要、最重要的因素。现已发现幽门螺旋杆菌对四环素、阿莫西林、喹诺酮、呋喃唑酮、甲硝唑、四环素类抗生素都有耐药菌株的产生，而且不同国家、地区对药物耐受情况也有差异。如图1所示，2007年统计的我国幽门螺旋杆菌对抗生素耐药率分别为：四环素0～40％(平均23.9％)，甲硝唑50％～100％(平均73.3％)，阿莫西林0～2.7％，喹诺酮类0～26.6％。幽门螺旋杆菌抗生素耐药机制较为复杂，主要与抗生素作用靶点相关基因突变有关。其中，幽门螺旋杆菌四环素耐药主要是由16SrDNA基因AGA926-928碱基改变所致，并且其耐药程度与突变碱基数目相关，突变碱基越多，其耐药性越高，其中以TTC突变耐药性最高，而单个和两个碱基的改变往往导致幽门螺旋杆菌四环素的低度和中度耐药。检测分析患者幽门螺杆菌16SrDNA耐药突变位点，能够在短时间内迅速的得到患者四环素耐药情况，有助于临床医师采取正确的治疗手段，提高幽门螺杆菌的根除率。鉴于幽门螺旋杆菌根除失败率的不断提高和传统幽门螺旋杆菌药敏实验的缺陷，发展新型的幽门螺旋杆菌耐药检测技术极为迫切。近年来随着对幽门螺旋杆菌耐药机制认知加深，以及各抗生素(尤其是四环素、四环素和喹诺酮类)耐药位点的鉴定，耐药突变检测在幽门螺旋杆菌耐药性检测中的作用正越来越被重视。扩增阻碍突变系统(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)于1989年建立，用于对己知突变基因进行检测。该法通过设计突变ARMS引物，其3’末端碱基与待检测突变型的突变碱基匹配，用于特异性扩增突变模板。ARMS的检测灵敏度依赖于ARMS引物的特异性和反应条件如酶，馍离子浓度等的优化。为了增加寻|物的特异性，减少引物与靶DNA有错配时的错配延伸，可通过在引物3’端的第23个碱基引入另外一个或者两个错配碱基，使之与模板之间形成多重错配以阻止错误延伸。ARMSqPCR技术基于Real-timePCR平台，结合ARMS突变富集和Taqman特异性荧光检测两种技术。利用ARMS引物对突变革巴序列进行PCR扩增，Taqman探针对扩增产物进行特异性位点检测，在Real-timePCR基础上鉴定特定突变。锁核酸(lockednucleicacid，LNA)是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2′-O，4′-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2′-O位和4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力，并具有抗3′脱氧核苷酸酶降解的稳定性、水溶性好、体内无毒性及合成简单等优点。其能够与DNA和RNA特异性地结合从而可以制备LNA探针，与DNA探针相比，其杂交的稳定性和特异性增加，可大大提高基因诊断的效率和灵敏度。基于上述内容，本方法用于用于幽门螺杆菌16SrDNA基因AGA926-928突变的检测，检测结果可用于指导幽门螺杆菌的根除治疗。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种幽门螺杆菌16SrDNA基因突变检测试剂盒，能有效地检测幽门螺杆菌16SrDNA基因耐药突变，使临床医生能获知患者幽门螺杆菌喹诺酮类抗生素耐药情况，有助于临床医生采取正确的治疗手段，提高幽门螺杆菌的根除率。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现：在本专利技术的第一个目的，提供了一种用于鉴定AGA926-928突变的ARMS-qPCR的引物组,优选的提供一种用于鉴定幽门螺杆菌16SrDNA基因AGA926-928突变是否含有突变位点ARMSqPCR的引物组。本专利技术提供的引物组，为如下1)或2)：1)由单独使用的16SrDNA的TTC926-928突变型的ARMS引物、16SrDNA的AGA926-928双碱基突变型的ARMS引物和16SrDNA的AGA926-928单碱基突变型的ARMS引物组成；2)由16SrDNA的TTC926-928突变型的ARMS引物、16SrDNA的AGA926-928双碱基突变型的ARMS引物和16SrDNA的AGA926-928单碱基突变型的ARMS引物组成：所述16SrDNA的TTC926-928突变型的ARMS引物的核昔酸序列为SEQIDNO:5；所述16SrDNA的AGA926-928双碱基突变型的ARMS引物的核昔酸序列为SEQIDNO:6-10；所述16SrDNA的AGA926-928单碱基突变型的ARMS引物的核昔酸序列为SEQIDNO:11-12。本专利技术的第二个目的是提供一种用于鉴定AGA926-928突变的ARMS-qPCR的引物探针组合,优选的,提供一种用于鉴定幽门螺杆菌16SrDNA是否存在AGA926-928突变的ARMS-qPCR的引物探针组合。本专利技术提供的所述的引物探针组合包括单独使用的引物探针组合A、引物探针组合B和引物探针组合C；所述引物探针组合A由锁核酸阻滞探针、通用TaqMan探针、PCR通用下游引物和16SrDNA的TTC926-928突变型的ARMS引物组成；所述引物探针组合B由锁核酸阻滞探针、通用TaqMan探针、PCR通用下游引物和16SrDNA的AGA926-928双碱基突变型的ARMS引物组成；所述引物探针组合C由锁核酸阻滞探针本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴定AGA926‑928突变的ARMS‑qPCR的引物组，其特征在于：所述引物组由16S rDNA的TTC926‑928突变型、AGA926‑928双碱基突变型、AGA926‑928单碱基突变型的ARMS引物组成；其中，所述16S rDNA的TTC926‑928突变型的ARMS引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:5；所述16S rDNA的AGA926‑928双碱基突变型的ARMS引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:6‑10；所述16S rDNA的AGA926‑928单碱基突变型的ARMS引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:11‑12。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定AGA926-928突变的ARMS-qPCR的引物组，其特征在于：所述引物组由16SrDNA的TTC926-928突变型、AGA926-928双碱基突变型、AGA926-928单碱基突变型的ARMS引物组成；其中，所述16SrDNA的TTC926-928突变型的ARMS引物的核苷酸序列为SEQIDNO:5；所述16SrDNA的AGA926-928双碱基突变型的ARMS引物的核苷酸序列为SEQIDNO:6-10；所述16SrDNA的AGA926-928单碱基突变型的ARMS引物的核苷酸序列为SEQIDNO:11-12。2.一种用于鉴定AGA926-928突变的ARMS-qPCR的引物探针组合，其特征在于：所述引物探针组合包括引物探针组合A、引物探针组合B和引物探针组合C；其中，所述引物探针组合A由锁核酸阻滞探针、通用TaqMan探针、PCR通用下游引物和16SrDNA的TTC926-928突变型的ARMS引物组成；所述引物探针组合B由锁核酸阻滞探针、通用TaqMan探针、PCR通用下游引物和16SrDNA的AGA926-928双碱基突变型的ARMS引物组成；所述引物探针组合C由锁核酸阻滞探针、通用TaqMan探针、PCR通用下游引物和16SrDNA的AGA926-928单碱基突变型的ARMS引物组成。3.根据权利要求2所述的一种用于鉴定AGA926-928突变的ARMS-qPCR的引物探针组合，其特征在于，所述锁核酸阻滞探针的核苷酸序列为SEQIDNO:2；所述通用TaqMan探针的核苷酸序列为SEQIDNO:4；所述16SrDNA的TTC926-928突变型的ARMS引物的核苷酸序列为SEQIDNO:5；所述16SrDNA的AGA926-928双碱基突变型的ARMS引物的核昔酸序列为SEQIDNO:6-10；所述16SrDNA的AGA926-928单碱基突变型的ARMS引物的核苷酸序列为SEQIDNO:11-12；所述PCR通用下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO:3。4.根据权利要求2所述的一种用于鉴定AGA926-928突变的ARMS-qPCR的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合还包括引物探针组合D，所述引物探针组合D由所述锁核酸阻滞探针、所述通用TaqMan探针、所述PCR通用下游引物和内控引物组成；所述内控引物的核苷酸序列为SEQIDNO:1。5.根据权利要求2所述的一种用于AGA926-928突变的ARMS-qPCR的引物探针组合，其特征在于，引物探针组合A中，所述锁核酸阻滞探针、所述通用TaqMan探针、所述PCR通用下游引物、所述16SrDNA的TTC926-928突变型的ARMS引物的摩尔比为5：2：4：4；所述引物探针组合B中，所述锁核酸阻滞探针、所述通用TaqMan探针、所述PCR通用下游引物、所述16SrDNA的AGA926-928双碱基突变型的ARMS引物的摩尔比为5：2：4：4；所述引物探针组合C中，所述锁核酸阻滞探针、所述通用TaqMan探针、所述PCR通用下游引物、所述16SrDNA的AGA926-928单碱基突变型的ARMS引物的摩尔比为5：2：4：4；所述引物探针组合D中，所述内控引物和通用TaqMan探针的摩尔比为1：1。6.一种用于鉴定AGA926-928突变的ARMS-qPCR的PCR试剂，其特征在于：所述PCR试剂包括PCR试剂A、PCR试剂B和PCR试剂C组成；其中，所述PCR试剂A由PCR扩增反应液、所述检测反应液A和水组成...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛海辉，郜恒骏，姚健，张小燕，张淼，
申请(专利权)人：上海芯超生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31