多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒，幽门螺杆菌耐药基因为以下3个基因：23S rRNA基因、16S rRNA基因、gyr A基因；试剂盒包括核酸提取试剂和核酸扩增试剂；核酸提取试剂包括超顺磁性氧化硅纳米磁珠、裂解液、洗涤液、洗脱液；核酸扩增试剂包括：分别与幽门螺杆菌耐药基因23S rRNA基因、16S rRNA基因、gyr A基因、内标基因人类管家基因β‑globin对应的引物对和探针。本发明专利技术可在单管中同时检测三个耐药位点和1个内标基因，提高样本检测通量；同时改善检测体系中多对引物探针间的干扰，有效提高试剂检测的灵敏度和特异性。

【技术实现步骤摘要】
多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒
本专利技术属于生物学检测
，涉及一种多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒。本试剂盒用于胃粘膜组织样本中对幽门螺杆菌gyrA基因、23SrRNA基因、16SrRNA基因上常见耐药突变的定性检测，辅助临床治疗的药物选择。
技术介绍
目前对幽门螺杆菌耐药的检测方法包括药敏检测、核酸测序、TaqMan实时荧光PCR法等。药敏检测为幽门螺杆菌耐药检测的金标准方法，可以直观确定幽门螺杆菌对何种抗生素具有耐药性；核酸测序法可以借助不同的测序引物对待测样本进行测序，通过对耐药基因核酸序列进行比对，评估耐药基因是否发生突变；TaqMan实时荧光PCR法借助荧光检测平台，实现分别对待测物各耐药基因的检测，可有效区分各耐药基因的突变方向。现有技术存在的问题：目前对幽门螺杆菌耐药检测的方法有多种，临床上使用较多的是体外药敏试验，即通过培养幽门螺杆菌与不同种类的抗生素进行体外培养从而确定其的最低抑菌浓度，从而判断是否对所测试抗生素具有耐药性。该方法大概可分为肉汤微量稀释法、纸片扩散法、E-test、琼脂稀释法等。纸片扩散法操作简单，价格较为低廉，但是缺乏可用的标准纸片浓度，没有标准的有效抑制直径，只能得到定性数据；肉汤微量稀释法操作较为繁琐，但能够得到细菌临床分离株对于抗菌药物的MIC值；琼脂稀释法是CLSI规定的检测幽门螺杆菌抗菌药物敏感性的标准方法，能够快速、准确得到临床分离株是否对某种抗生素具有耐药性，但是该方法操作繁琐，技术要求高，需要花费大量时间，常被用作评估其他方法的对照法或进行大样本的研究，不适合运用于临床个例；E-test法可测定连续的MIC值，且适合运用于幽门螺杆菌这种生产缓慢的细菌，操作简单，在临床标本的使用上比较方便，但价格较高、不易普及推广。中国专利技术专利申请CN201610943701公开了一种检测幽门螺杆菌耐药突变位点的试剂盒和方法，该专利是利用经过blocker修饰的引物对未发生突变的耐药位点进行封闭，然后利用ARMS引物针对突变的耐药位点进行扩增，通过ARMS引物对各耐药位点进行突变检测。在该检测过程中存在以下几方面问题：1、Blocker修饰的引物与扩增引物竞争与靶标结合，降低扩增引物与靶标的结合效率，导致灵敏度降低；2、ARMS引物检测原理是依靠个别碱基差异进行型别区分，因此会出现由于引物错配引起的假阳性结果，导致特异性降低；3、该体系中需要针对不同的突变位点需设置不同的ARMS引物和blocker引物，试剂成本会比较高，提高检测成本，增加病人的检测费用。4、检测一个样本的7个碱基突变方向，需要1个样本检测8次，以确定碱基是否发生突变，导致在临床检测中操作繁琐、检测通量低，检测费用高，不适于临床使用。中国专利技术专利申请CN201810901562公开了一种基于人工模拟核酸分子信标的检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点的方法与试剂盒，该专利的本质是进行荧光PCR检测，只是检测探针使用具有茎环结构的beacon探针，增加探针的稳定性，降低背景值。但是它存在以下几方面问题：1、使用荧光PCR法对幽门螺杆菌进行突变检测，单孔中只能进行一个突变位点的单个方向的突变检测，不同位点及不同突变方向需要在不同的反应管中进行，样本的检测通量小；2、该专利只能检测幽门螺杆菌的23SrRNA基因2142、2143位点是否发生突变，不能判断该样本是否感染野生型的幽门螺杆菌；3、该专利只能检测幽门螺杆菌23SrRNA基因上2142和2143位点的突变，不能同时对喹诺酮类抗生素和四环素的耐药基因进行突变检测，增加临床检测的成本及时间。4、该专利所描述的试剂盒中不设置内对照，不能监控样本从取样、提取、扩增等过程中是否存在异常，不能保证结果的准确性。中国专利技术专利申请CN201911327235公开了检测幽门螺杆菌的分子信标探针、试剂盒及其检测方法，该专利利用beacon探针进行荧光原位杂交检测，存在以下几个问题：1、检测过程步骤较为繁琐，经过杂交，多次清洗等步骤，操作时间较长，且操作过程中容易丢失信号，出现假阴性结果；2、探针不能达到100%杂交到靶片段上，杂交率受到探针的影响，降低检测灵敏度；3、在胃粘膜样本中利用探针杂交的方法检测幽门螺杆菌，未经过PCR扩增，样本中的幽门螺杆菌含量低时，不能检出阳性，导致漏检，降低灵敏度。4、该方法虽然不需要配备PCR仪，但是后期杂交结果需要通过显微镜目测进行判读，结果保存不完整、结果判定受到人为因素影响较大，且显微镜的使用限制该种检测方法无法推广到临床单位或基础医疗单位进行相关检测。分子生物学技术检测幽门螺杆菌耐药性的方法也较多，其中以PCR技术及其衍生的分子技术是重要的检测手段，常规的荧光PCR检测进行多个耐药基因的突变检测时，由于本身检测原理及扩增仪荧光检测通道个数的限制，导致临床样本的检测通量降低，增加临床检测的工作量。熔解曲线法是在PCR扩增后加入熔解曲线程序，通过杂交荧光值的变化判断待检物的检测结果。由于荧光染料多为非特异性结合，限制了单个反应管中的靶标检测个数，因此采用荧光熔解曲线法检测幽门螺杆菌多个耐药基因目前存在一定的技术困难或技术障碍。目前尚未有文献公开采用熔解曲线法检测幽门螺杆菌多个耐药基因的应用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因（16SrRNA、23SrRNA、gyrA基因）多态性的试剂盒。其解决了现有技术熔解曲线法由于荧光染料多为非特异性结合，限制了单个反应管中的靶标检测个数的局限性。本专利技术使用荧光素对不同靶标进行标记，根据荧光素的差异，区分同一样本管中不同靶标的检出结果。通过不同的体系优化和引物筛选，本专利技术可在单管中同时检测三个耐药位点和1个内标基因，提高样本检测的检测通量；同时改善了检测体系中多对引物探针间的干扰，对探针进行优化降低背景荧光值，有效提高试剂检测的灵敏度和特异性，从而最终达到利用荧光熔解曲线同时检测幽门螺杆菌三个耐药位点的目的，为临床治疗幽门螺杆菌耐药基因的检测提供快速、高效的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒，所述幽门螺杆菌耐药基因为以下3个基因：23SrRNA基因、16SrRNA基因、gyrA基因；所述耐药基因突变位点为：克拉霉素（2142A>G、2142A>C、2143A>G），四环素（926-928AGA），喹诺酮类（Asn87-LysAsp91-Gly/Asn/Tyr）；所述试剂盒包括核酸提取试剂和核酸扩增试剂；所述核酸提取试剂包括超顺磁性氧化硅纳米磁珠、裂解液、洗涤液、洗脱液；所述核酸扩增试剂包括：与幽门螺杆菌耐药基因23SrRNA基因对应的引物对和探针、与幽门螺杆菌耐药基因16SrRNA基因对应的引物对和探针、与幽门螺杆菌耐药基因gyrA基因对应的引物对和探针、以及与内标基因人类管家基因β-globin对应的引物对和探针；所述与幽门螺杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述幽门螺杆菌耐药基因为以下三个耐药基因：23S rRNA基因、16S rRNA基因、gyr A基因；所述耐药基因突变位点为：克拉霉素（2142A>G、2142A>C、2143A>G），四环素（926-928AGA），喹诺酮类（Asn87-Lys Asp91-Gly/Asn/Tyr）；所述试剂盒包括核酸提取试剂和核酸扩增试剂；所述核酸提取试剂包括超顺磁性氧化硅纳米磁珠、裂解液、洗涤液、洗脱液；所述核酸扩增试剂包括：与幽门螺杆菌耐药基因23S rRNA基因对应的引物对和探针、与幽门螺杆菌耐药基因16S rRNA基因对应的引物对和探针、与幽门螺杆菌耐药基因gyr A基因对应的引物对和探针、以及与内标基因人类管家基因β-globin对应的引物对和探针；/n所述与幽门螺杆菌耐药基因23S rRNA基因对应的引物对和探针，其上游引物为如SEQID NO.1所示序列，其下游引物为如SEQ ID NO.2所示序列，其探针序列为如SEQ ID NO.3所示序列；/n所述与幽门螺杆菌耐药基因16S rRNA基因对应的引物对和探针，其上游引物为如SEQID NO.4所示序列，其下游引物为如SEQ ID NO.5所示序列，其探针序列为如SEQ ID NO.6所示序列；/n所述与幽门螺杆菌耐药基因gyr A基因对应的引物对和探针，其上游引物为如SEQ IDNO7所示序列，其下游引物为如SEQ ID NO.8所示序列，其探针序列为如SEQ ID NO.9所示序列。/n...

【技术特征摘要】
1.一种多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述幽门螺杆菌耐药基因为以下三个耐药基因：23SrRNA基因、16SrRNA基因、gyrA基因；所述耐药基因突变位点为：克拉霉素（2142A>G、2142A>C、2143A>G），四环素（926-928AGA），喹诺酮类（Asn87-LysAsp91-Gly/Asn/Tyr）；所述试剂盒包括核酸提取试剂和核酸扩增试剂；所述核酸提取试剂包括超顺磁性氧化硅纳米磁珠、裂解液、洗涤液、洗脱液；所述核酸扩增试剂包括：与幽门螺杆菌耐药基因23SrRNA基因对应的引物对和探针、与幽门螺杆菌耐药基因16SrRNA基因对应的引物对和探针、与幽门螺杆菌耐药基因gyrA基因对应的引物对和探针、以及与内标基因人类管家基因β-globin对应的引物对和探针；
所述与幽门螺杆菌耐药基因23SrRNA基因对应的引物对和探针，其上游引物为如SEQIDNO.1所示序列，其下游引物为如SEQIDNO.2所示序列，其探针序列为如SEQIDNO.3所示序列；
所述与幽门螺杆菌耐药基因16SrRNA基因对应的引物对和探针，其上游引物为如SEQIDNO.4所示序列，其下游引物为如SEQIDNO.5所示序列，其探针序列为如SEQIDNO.6所示序列；
所述与幽门螺杆菌耐药基因gyrA基因对应的引物对和探针，其上游引物为如SEQIDNO7所示序列，其下游引物为如SEQIDNO.8所示序列，其探针序列为如SEQIDNO.9所示序列。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端和3’端分别连接有荧光报告基团和荧光淬灭基团；其中，荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、CY3、Red-X、TAMRA、ROX中的任意两种；荧光淬灭基团选自Dabcy1、BHQ1、BHQ2、MGB中的任意一种或两种。


3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述人类管家基因β-globin的引物对，其序列如下：
上游引物：5’-GTGCACCTGACTCCTGAGGA-3’，如SEQIDNO.10所示序列；
下游引物：5’-CTTGATACCAACCTGCCCAG-3’，如SEQIDNO.11所示序列；
所述人类管家基因β-globin的探针序列如下：
5’-AGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGG-3’，如SEQIDNO.12所示序列；探针的5’端标记HEX基团作为荧光基团，3’端使用BHQ1作为淬灭基团。


4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂中，裂解液为异硫氰酸胍、盐酸胍和柠檬酸三钠中的任意一种或多种；洗涤液为乙醇和/或胍盐；洗脱液为TE缓冲液。


5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂还包括PCR缓冲溶液和盐溶液。


6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲溶液为Tris-HCl；所述盐溶液为MgSO4或KCl；按照反应体系25μL计算，限制性引物如SEQIDNO.1、SEQIDNO.4、SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：郜恒骏，孟影，张小燕，沈维祥，陈春峰，
申请(专利权)人：上海芯超生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31