检测对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌的引物组及含有该引物组的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测对虾急性肝胰腺坏死病‑副溶血弧菌的引物组及含有该引物组的试剂盒，属于水产病原生物检测试剂技术领域。本发明专利技术检测对虾急性肝胰腺坏死病‑副溶血弧菌的引物组，根据SEQ ID No:1所示核酸序列设计。用本发明专利技术引物组检测对虾急性肝胰腺坏死病‑副溶血弧菌，不仅克服了现有技术中对大型昂贵仪器依赖、检测操作复杂的问题；而且，本发明专利技术引物组的检测灵敏度高、特异性好，适用于水产养殖场等简陋条件的快速测定。

A primer set for detection of Vibrio parahaemolyticus from acute hepatopancreatic necrosis disease of penaeid shrimp and the kit containing the primer set

【技术实现步骤摘要】
检测对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌的引物组及含有该引物组的试剂盒
本专利技术属于水产病原生物检测试剂
，具体涉及一种检测对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌的引物组及含有该引物组的试剂盒。
技术介绍
急性肝胰腺坏死病(acutehepatopancreaticnecrosisdisease,AHPND)，又被称为早期死亡综合征(earlymortalitysyndrome,EMS)，是近年来严重危害对虾养殖的一种新发疫病。该病2010年前后首先在越南和中国的对虾养殖中出现，随后传播到东南亚以及中美洲等地，该病在放苗后7～31d出现肝胰腺萎缩、发黄，死亡率达90％，使全球对虾养殖业每年损失近10亿美元；严重影响了对虾产业的发展。对于AHPND的病原，至今还未有明确的定论，目前比较公认的病原是一种独特的副溶血弧菌分离株(VibrioparahaemolyticuscausingAHPND，VpAHPND)，该副溶血弧菌携带含有二元Pir样毒素基因pirAvp和pirBvp的69kbp质粒(pAP1)；研究发现，因该副溶血弧菌含有编码PirA和PirB毒素的质粒而对虾类具有致死性。水产病原的快速诊断，对水产养殖的良种选育，疾病预防、进出口检疫、水产品食品安全等方面具有重大意义。当前，水产病原防治中常见的病原检测方法包括组织病理切片观察、病毒分离培养、抗原血清反应、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、核酸杂交技术和一般聚合酶链反应(PCR)技术等。目前的检测方法均存在依赖精密仪器、检测成本高、灵敏性和特异性差，操作程序繁琐，难以推广等缺点；而且常规的病原检测技术大都不适合养殖基层的现场快速检测。LAMP技术是一种新的DNA扩增方法，该技术依赖于自动循环的链置换反应，通过识别靶序列上6个特异区域的引物和具有链置换的DNA聚合酶，在等温条件下，不到1h就能扩增出109靶序列拷贝，具有特异、灵敏、快速、简便等特点，与普通PCR、荧光定量PCR技术相比，LAMP的优点突出：(1)不需要昂贵的精密仪器，恒温状态即可；(2)扩增效率高，能够获得大量扩增产物；(3)具有高特异性；(4)通过添加Loop引物，可以加快反应，缩短一半的时间；(5)因扩增产生大量的副产物焦磷酸镁白色沉淀，肉眼即可观察结果。因而，可以检测水产经济动物体内的病原菌、病毒、寄生虫和真菌等病原生物，适合于养殖基层的现场快速检测。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种检测对虾急性肝胰腺坏死病病原-副溶血弧菌的引物组及含有该引物组的试剂盒，用本专利技术引物组检测对虾急性肝胰腺坏死病的病原副溶血弧菌，不仅克服了现有技术中对大型昂贵仪器依赖、检测操作复杂的问题；而且，本专利技术引物组的检测灵敏度高、特异性好，适用于水产养殖场等简陋条件的快速测定。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：检测对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌的引物组，所述引物组序列为：F3：5’-GTCGTGGTTTCTGTACAATC-3’；B3：5’-GCCAAAAGATATTCCATAACGT-3’；FIP：5’-AGGGTTAAATTCCGTCAAAGATGACTAAGAAGGTGCTCACATGAC-3’；BIP：5’-CTATGCTTTCAAAGCAATGGTTTCAATAAAAAACCACCCGCGTAA-3’；或F3：5’-TGATAATGCATTCTATCATCAGC-3’；B3：5’-ATTTGAAAGACCAAATGAAACC-3’；FIP：5’-GTGAGCACCTTCTTAGTGGTAATAGTTGTAATTAACAATGGCGCTAG-3’；BIP：5’-TGACGGAATTTAACCCTAACAATGCGCTTTGAAAGCATAGTTAGGATC-3’；或F3：5’-CAATACCAATGGGGTGCG-3’；B3：5’-TCGTTAGTCATGTGAGCAC-3’；FIP：5’-CAGGGCGTTGTAAATGGTAAGTCTGGAAAGTGGCTAAATCAC-3’；BIP：5’-GCATTCTATCATCAGCGTATTGTTGAGTGGTAATAGATTGTACAGAAAC-3’；LF：5’-TTCATCACGTTGTACCACAT-3’LB：5’-ATTAACAATGGCGCTAGTCG-3’。本专利技术上述引物组序列是根据SEQIDNo:1所示核酸序列的第305～538位、第255～489位或160～359位核酸序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计。上述引物组在制备对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌检测试剂中的应用。一种对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌检测试剂盒，包含上述的至少一组引物组。在上述方案的基础上，所述对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌的检测试剂盒，还包含反应缓冲液、BstDNA聚合酶、钙黄绿素、dNTPs、ddH2O(RNase-free)和阳性对照。在上述方案的基础上，所述的阳性对照为含有SEQIDNo:1所示核酸序列的T克隆载体。在上述方案的基础上，采用上述试剂盒检测对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌时，反应温度为63℃，反应时间为60min。本专利技术的有益效果：本专利技术的引物组是根据对虾急性肝胰腺坏死病病原-副溶血弧菌基因中的一段序列SEQIDNo:1；采用PrimerExploerV4软件设计的3套LAMP特异性引物组合，分别为AHPND-1、AHPND-2、AHPND-3。每套引物至少包含两条内引物(FIP和BIP)、两条外引物(F3和B3)，还可以包含一条或两条环引物(LF和/或LB)。基于上述引物组，本专利技术采用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediatedisothermamplification，LAMP)用于检测对虾急性肝胰腺坏死病病原-副溶血弧菌，通过初步筛选，确定将AHPND-2、AHPND-3用于检测对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌，并分别对AHPND-2、AHPND-3的特异性和灵敏度进行验证，特异性检测结果显示，引物组AHPND-2、AHPND-3对水、石斑鱼虹彩病毒、石斑鱼神经坏死病毒、白斑综合征病毒、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒、哈维氏弧菌、对虾虹彩病毒、对虾肝肠胞虫、镰刀真菌均无非特异性扩增，灵敏性检测结果显示AHPND-2最低检出限为1ag/μL-10ag/μL，AHPND-3最低检出限为1ag/μL-10ag/μL。附图说明图1各组引物的初步扩增结果；图2自然光下各组引物的初步扩增结果(从左到右各管内的引物及对应的模板分别为：AHPND-1+阳性质粒，AHPND-1+AP1，AHPND-1+水(平行1)，AHPND-1+水(平行2)，AHPND-2+阳性质粒，AHPND-2+AP1，AHPND-2+水(平行1)，AHPND-2+水(平行2)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌的引物组，其特征在于，所述引物组序列为：/nF3：5’-GTCGTGGTTTCTGTACAATC-3’；/nB3：5’-GCCAAAAGATATTCCATAACGT-3’；/nFIP：5’-AGGGTTAAATTCCGTCAAAGATGACTAAGAAGGTGCTCACATGAC-3’；/nBIP：5’-CTATGCTTTCAAAGCAATGGTTTCAATAAAAAACCACCCGCGTAA-3’；/n或/nF3：5’-TGATAATGCATTCTATCATCAGC-3’；/nB3：5’-ATTTGAAAGACCAAATGAAACC-3’；/nFIP：5’-GTGAGCACCTTCTTAGTGGTAATAGTTGTAATTAACAATGGCGCTAG-3’；/nBIP：5’-TGACGGAATTTAACCCTAACAATGCGCTTTGAAAGCATAGTTAGGATC-3’；/n或/nF3：5’-CAATACCAATGGGGTGCG-3’；/nB3：5’-TCGTTAGTCATGTGAGCAC-3’；/nFIP：5’-CAGGGCGTTGTAAATGGTAAGTCTGGAAAGTGGCTAAATCAC-3’；/nBIP：5’-GCATTCTATCATCAGCGTATTGTTGAGTGGTAATAGATTGTACAGAAAC-3’；/nLF：5’-TTCATCACGTTGTACCACAT-3’/nLB：5’-ATTAACAATGGCGCTAGTCG-3’。/n...

【技术特征摘要】
1.检测对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌的引物组，其特征在于，所述引物组序列为：
F3：5’-GTCGTGGTTTCTGTACAATC-3’；
B3：5’-GCCAAAAGATATTCCATAACGT-3’；
FIP：5’-AGGGTTAAATTCCGTCAAAGATGACTAAGAAGGTGCTCACATGAC-3’；
BIP：5’-CTATGCTTTCAAAGCAATGGTTTCAATAAAAAACCACCCGCGTAA-3’；
或
F3：5’-TGATAATGCATTCTATCATCAGC-3’；
B3：5’-ATTTGAAAGACCAAATGAAACC-3’；
FIP：5’-GTGAGCACCTTCTTAGTGGTAATAGTTGTAATTAACAATGGCGCTAG-3’；
BIP：5’-TGACGGAATTTAACCCTAACAATGCGCTTTGAAAGCATAGTTAGGATC-3’；
或
F3：5’-CAATACCAATGGGGTGCG-3’；
B3：5’-TCGTTAGTCATGTG...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛辉，周宸，林琪，吴建绍，
申请(专利权)人：福建省水产研究所福建水产病害防治中心，
类型：发明
国别省市：福建;35