一种沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用，属于微生物检测领域，该参考样品采用包含来源于沙门氏菌的肠伤寒特异性序列se、鼠伤寒特异性序列st以及共有的aceA基因的片段插入质粒中形成，各基因以1:1:1比例串联，基因间以不相关的基因片段进行隔开；本参考品包含明确的se、st、aceA三种检测基因片段，序列来源清晰，而且均按照单拷贝方式保存于质粒中，不仅可以用于定性检测，还可以作为量值可溯源的参考品进行试剂性能鉴定和实验室之间能力评价。

【技术实现步骤摘要】
一种沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用
本专利技术涉及微生物检测领域，特别是涉及一种沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用。
技术介绍
沙门菌(salmonella,Sa)属于肠杆菌科，是威胁人类及动物健康的食源性致病微生物，能够引起伤寒、副伤寒、肠胃炎及败血症等严重疾病。在世界各国细菌性食物中毒病例中，其引起的食物中毒常居榜首或第二位。沙门氏菌在日常生活中非常常见，如在生鸡蛋壳、家禽，红肉中，除此之外，被污染的水是全世界沙门氏菌的主要来源。有数据已经证实在发展中国家约有2000万人感染沙门氏菌，同样的在美国，德国等国家也是沙门氏菌的多发地。沙门氏菌的血清型有超过2500种，但是英国的一项调查表明，肠炎沙门菌(salmonellaenteritidis,SE)和鼠伤寒沙门菌(salmonellatyphimurium,ST)感染占到人类Sa感染患者的75％以上。因此，快速鉴定并确定沙门氏菌的型别，对食品安全具有重要的意义。目前沙门氏菌的检测方法在不断的快速发展中，聚合酶链式反应(PCR)等核酸检测技术的不断提升一定程度的克服了传统检测方法耗时长、操作复杂、特异性差等缺点。基于核酸的检测特异性强、灵敏度高、快速等优点已成为食源性病原微生物常规的检测方法之一，在食源性病原微生物检测中发挥着重要的作用。但是目前用于PCR的阳性核酸参考品十分缺乏。要同时进行沙门氏菌的鉴定和型别分析，往往要使用多个基因组参考品才能完成，而基因组参考品中检测靶基因的量值，又难以确定和溯源，因此使用基因组DNA作为参考品，缺点是难以同时为多个靶标提供可溯源的定量参考。因此在检测效果和实验室结果评价方面存在严重不足。质粒DNA参考物质(pDNA)是一类含有所检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，具有稳定性好、准确度高的特点。它不仅可以在核酸的定性检测中作为阳性对照，还可在定量分析中作为定量标准，构建定量分析的标准曲线。因此，质粒DNA参考物质在核酸检测的可追溯性过程中也可起到关键作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：本专利技术提供一种沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；其采用包含来源于不同沙门氏菌菌株的se、st、aceA基因的片段插入质粒中形成；所述se、st、aceA基因以1:1:1比例串联；所述se、st、aceA基因间以不相关的基因片段进行隔开。进一步地，在260nm和280nm处的光密度值比值在1.8-2.0之间。进一步地，所述不相关的基因片段的核苷酸序列为aagtcg。本专利技术还提供一种上述的沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品的制备方法，包括：人工合成沙门氏菌基因se、st、aceA，基因之间用所述不相关的基因片段间隔；合成后克隆插入质粒中，经沙门氏菌扩增后，提取并提纯质粒；测定浓度并分装；-70℃预冻，经升华和再干燥后，得到冻干粉，即所述沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品。进一步地，所述质粒为pUC57载体质粒。进一步地，所述方法还包括对核酸标准样品定性鉴定，通过特异性引物进行PCR扩增或测序进行定性分析，来确认所制备的质粒参考品包含完整和准确的目的DNA。本专利技术还提供一种上述的沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品在检测沙门氏菌中的应用。进一步地，在进行沙门氏菌检测时，所述沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品作为参考品或对照品。本专利技术公开了以下技术效果：(1)本专利技术的用于检测沙门氏菌的参考品针对生物制品成品、中间品及其原料中沙门氏菌se、st、aceA三种检测靶标序列的检测，提供统一参考品。不仅可以用于沙门氏菌的定性检测，还可以作为鼠伤寒和肠伤寒鉴别的参考品。(2)相对于现有的沙门氏菌基因组参考品，所有遗传信息只来源于单一菌株，无法在定性检测的同时进行型别检测，需要多个基因组参考品才能准确进行沙门氏菌的鉴定。而且基因组参考品所包含的检测靶标无法进行定量分析的情况，本参考品所包含明确的se、st、aceA三种检测基因，序列来源清晰，而且均按照单拷贝方式保存于质粒中，不仅可以用于定性检测和型别鉴定，还可以作为进行试剂性能鉴定和实验室之间能力评价的参考品。(3)本专利技术用于检测沙门氏菌的参考品经测序检测其基因序列，明确物种是沙门氏菌来源，而后经三家以上实验室协作标定确定参考品的量值，并研究其均一性，稳定性等信息；参考品序列、均一性稳定性等信息均有明确信息。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为质粒DNA标准物质pDNASalmonella的图谱；图2为质粒DNA标准物质pDNASalmonella建立的实时荧光PCR标准曲线。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。在不背离本专利技术的范围或精神的情况下，可对本专利技术说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本专利技术的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。专利技术历程为了能够提供为多个检测靶标进行定性定量参考的参考品，本研究针对沙门菌的aceA基因、肠炎沙门菌特异序列se、鼠伤寒沙门菌的特异性序列st，通过人工合成方法制备了核酸检测参考品，实验结果表明，人工合成的肠炎伤寒沙门氏菌片段准确包含se、st、aceA基因序列，成功插入PUC57质粒后能够在大肠杆菌中稳定扩增。经过多个实验室联合定值后，可获得序列和量值均本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；/n其采用包含来源于不同沙门氏菌菌株的肠伤寒特异性序列se、鼠伤寒特异性序列st以及共有的aceA基因的片段插入质粒中形成；/n所述se、st、aceA基因以1:1:1比例串联；/n所述se、st、aceA基因间以不相关的基因片段进行隔开。/n

【技术特征摘要】
1.一种沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；
其采用包含来源于不同沙门氏菌菌株的肠伤寒特异性序列se、鼠伤寒特异性序列st以及共有的aceA基因的片段插入质粒中形成；
所述se、st、aceA基因以1:1:1比例串联；
所述se、st、aceA基因间以不相关的基因片段进行隔开。


2.根据权利要求1所述的沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品，其特征在于，在260nm和280nm处的光密度值比值在1.8-2.0之间。


3.根据权利要求1所述的沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品，其特征在于，所述不相关的基因片段的核苷酸序列为aagtcg。


4.一种权利要求1-3任一项所述的沙门氏菌核酸检测质粒DNA参考样品的制备方法，其特征在于，包括：
人工合成沙门氏菌基因s...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁慕云，许龙岩，陈瑶，郝文波，刘二龙，
申请(专利权)人：广州海关技术中心，
类型：发明
国别省市：广东;44