【技术实现步骤摘要】
一种基于核酸扩增耦联G四联体DNA酶可视化检测沙门氏菌的方法
本专利技术属于微生物检测领域，具体涉及了一种基于核酸扩增耦联G四联体DNA酶可视化检测沙门氏菌的方法。
技术介绍
据世界卫生组织报道，沙门氏菌是全球四大腹泻病病因之一。据估计，沙门氏菌每年约造成340万例感染，681316例死亡，其中几乎2/3的病例发生在5岁以下的儿童中，沙门氏菌感染仍然是全球范围内的食品安全问题。据CDC统计的关于食品中沙门氏菌污染的事件，沙门氏菌易感染于鸡蛋、肉类、鲜切水果及未经高温消毒的牛奶等快消食品中，因此，为了保证食品的安全性，准确、高效的沙门氏菌检测也变得越来越重要。食品中沙门氏菌的常规检测方法是平板培养法，包括菌落计数和标准生化鉴定，一般需要2到3天对致病菌进行初步鉴定，额外需要长达一周的时间进一步确认致病菌的种类，既费时又费力。基于抗原抗体间相互作用的免疫学检测方法和基于核酸的检测方法也越来越多的应用到食品中沙门氏菌的检测中。与传统平板培养法相比，免疫学检测的检测时间要大大缩短，然而与相关细菌抗原的交叉反应、抗原变...
【技术保护点】
1.一种基于核酸扩增耦联G四联体DNA酶可视化检测沙门氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)提取待测样品的基因组DNA；/n2)LAMP扩增：以步骤1)提取的基因组DNA作为模板，在LAMP扩增体系中进行LAMP扩增，65℃孵育得到LAMP扩增产物；/n3)对步骤2)所得的LAMP扩增产物进行ScrFI限制性内切酶切割得到限制酶切割产物；/n4)步骤3)得到的限制酶切割产物通过切刻内切酶切刻、DNA聚合酶延伸及链置换过程的循环往复产生多条单链DNA：在步骤3)得到的限制酶切割产物中加入1×IsothermalAmplification Buffer II Pack缓...
【技术特征摘要】
1.一种基于核酸扩增耦联G四联体DNA酶可视化检测沙门氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)LAMP扩增：以步骤1)提取的基因组DNA作为模板，在LAMP扩增体系中进行LAMP扩增，65℃孵育得到LAMP扩增产物；
3)对步骤2)所得的LAMP扩增产物进行ScrFI限制性内切酶切割得到限制酶切割产物；
4)步骤3)得到的限制酶切割产物通过切刻内切酶切刻、DNA聚合酶延伸及链置换过程的循环往复产生多条单链DNA：在步骤3)得到的限制酶切割产物中加入1×IsothermalAmplificationBufferIIPack缓冲液、Bst3.0DNA聚合酶、Nt.BstNBI切刻内切酶和dNTPs，并用ddH2O补足，58.8℃孵育10min；
5)富G序列的产生：在步骤4)得到的产物中加入1μM的分子机器M-G继续孵育，然后95℃孵育5min后立即置于冰上；
6)显色反应：在30μL步骤5)得到的含富G序列的产物中加入1×HEPES缓冲液、辅因子氯高铁血红素以及HCl混匀，随后加入ABTS2-和H2O2，使反应终体积为100μL，通过反应显色实现对沙门氏菌的可视化检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于核酸扩增耦联G四联体DNA酶可视化检测沙门氏菌的方法，其特征在于，所述步骤2)中的LAMP扩增体系的总体积为10μL，其中包括1μL基因组DNA模板、1.6μM内引物1和内引物2、0.2μM外引物1和外引物2、0.4μM环引物1和环引物2、1.4mMdNTPs、3.2UBstDNAPolymeraseLargeFragment、1×ThermoPolBuffer、6mMMgSO4。
3.根据权利要求2所述的一种基于核酸扩增耦联G四联体DNA酶可视化检测沙门氏菌的方法，其特征在于，所述内引物1、内引物2、外引物1、外引物2、环引物1、环引物2的核苷酸序列如下所示：
内引物1：
TCCCGGCAGAGTTCCCATTGAAGAGTCATCATGACGCAGCTGTTGAA
内引物2：TTCCCGCTGCCGGTATTTGTTGCTACGTTTTGCTTCACGGA
外引物1：GCGATAATATGGGGCGGAAT
外引物2：CGCCTTTGCTGGTTTTAGGT
环引物1：TATT...
【专利技术属性】
技术研发人员：王柳，陈雨浓，何开雨，徐霞红，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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