一种GBS DNA核酸检测方法技术

本发明专利技术公开了一种GBS DNA核酸检测方法，包括以下步骤：在无菌涤纶拭子管中加入生理盐水，混匀制成标本悬浮液；13000rpm离心10min弃上清；沉淀加无水乙醇，混匀，10000‑13000rpm离心5‑10min弃上清；沉淀加无菌生理盐水，混匀，13000rpm离心5min弃上清；沉淀加入DNA提取液，混匀，加热处理；13000rpm离心10min，取上清；向PCR反应管中加入待测样品后瞬时离心；将PCR反应管置于实时荧光定量PCR仪中，进行扩增反应，根据扩增曲线进行结果判读。本发明专利技术步骤简单，且易于推广，使用本发明专利技术方法后提高了2.4%左右的检出率，更有利于临床指导用药，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种GBSDNA核酸检测方法
本专利技术涉及核酸检测方法领域，具体是一种GBSDNA核酸检测方法。
技术介绍
B族链球菌为兼性厌氧的革兰氏阳性链球菌，正常寄居于阴道和直肠，正常妇女带菌率达30%左右，属于条件致病菌，孕妇可感染并通过产道传播给新生儿，引起新生儿败血症、脑膜炎、肺炎等，死亡率极高，是目前引发新生儿感染最主要的致病菌之一。患者会采集两个采样部位的标本送检，采取部位有直肠和阴道，往往会采集到较多的粪便/分泌物，会导致实验结果受到抑制，无扩增曲线。
技术实现思路
本专利技术就是为了解决上述技术问题，所提供了一种GBSDNA核酸检测方法。本专利技术是按照以下技术方案实现的。一种GBSDNA核酸检测方法，包括以下步骤：a.在无菌涤纶拭子管中加入生理盐水，混匀制成标本悬浮液；b.取出全部样品，13000rpm离心10min弃上清；c.步骤b中获得的沉淀加无水乙醇，混匀，10000-13000rpm离心5-10min弃上清；d.步骤c中获得的沉淀加无菌生理盐水，混匀，13000rpm离心5-10min弃上清；e.步骤d中获得的沉淀加入DNA提取液，混匀，加热处理；f.13000rpm离心10min，吸取上清保存；g.向PCR反应管中加入步骤f中获得的待测样品后瞬时离心；h.将PCR反应管置于实时荧光定量PCR仪中，进行扩增反应，根据扩增曲线进行结果判读。进一步的，步骤c中，离心条件为13000rpm离心5min。进一步的，步骤e中，加热处理条件为100±5℃加热处理10-12min。进一步的，步骤g中，将待测样品加入PCR反应管的同时，分别将提取好的GBS阳性对照品和空白对照品也加入PCR反应管。进一步的，所述GBS阳性对照品的提取方法为：取GBS阳性对照品，13000rpm离心10分钟，弃上清；沉淀加入DNA提取液充分混匀，100℃加热处理10分钟；13000rpm离心10分钟，吸取上清保存；所述空白对照品的提取方法与GBS阳性对照品的提取方法相同。进一步的，步骤h中，实时荧光定量PCR的反应条件为：a.UNG反应：50℃2min；b.预变形：95℃5min；c.PCR：95℃15s-60℃35s共45个循环；60℃时分别检测FAM和HEX通道的荧光信号，选择反应体系40uL。本专利技术获得了如下的有益效果。本专利技术的GBSDNA核酸检测方法步骤简单，且易于推广，使用本专利技术方法后提高了2.4%左右的检出率，更有利于临床指导用药，具有广阔的应用前景。附图说明图1是本专利技术方法实时荧光定量PCR扩增曲线图（样品为阴性）；图2是本专利技术方法实时荧光定量PCR扩增曲线图（样品为阳性）；图3是本专利技术方法实时荧光定量PCR扩增曲线图（样品需复测）；图4是本专利技术方法实时荧光定量PCR扩增曲线图（样品复测后为阴性）；图5是现有技术方法实时荧光定量PCR扩增曲线图。具体实施方式下面结合附图及实施例对本专利技术进行进一步说明。实施例一种GBSDNA核酸检测方法，包括以下步骤：1.在无菌涤纶拭子管中加入1mL生理盐水，用漩涡振荡器震荡混匀制成标本悬浮液。2.取出全部样品放入1.5mL离心管中，13000rpm离心10min弃上清。3.沉淀加无水乙醇1mL混匀，13000rpm离心5min弃上清。4.沉淀加无菌生理盐水1mL混匀，13000rpm离心5min弃上清。5.沉淀加入50uLDNA提取液（B族链球菌（GBS）核酸检测试剂盒/博尔诚（北京）科技有限公司）充分震荡混匀，100℃加热处理10min。6.13000rpm离心10min，吸取上清至1.5mL离心管中保存，DNA提前完毕。7向准备好的PCR反应管中分别加入5uL待测样品、提取好的阳性对照品和空白对照品（B族链球菌（GBS）核酸检测试剂盒/博尔诚（北京）科技有限公司），盖紧管盖后瞬时离心。GBS阳性对照品提取：取50uLGBS阳性对照品加入1.5uL离心管中（用灭菌生理盐水补齐至1mL），13000rpm离心10分钟，弃上清。沉淀加入50uLDNA提取液充分混匀，100℃加热处理10分钟，13000rpm离心10分钟，吸取上清至1.5mL离心管中保存，DNA提取完毕。空白对照提取：同GBS阳性对照品提取。8.通过样品传递窗转移至扩增区。9.将待测PCR反应管小心置于ABI7500实时荧光定量PCR仪中，进行扩增反应，根据扩增曲线进行结果判读。实时荧光定量PCR的反应条件为：a.UNG反应：50℃2min；b.预变形：95℃5min；c.PCR：（95℃15秒-60℃35秒）45个循环；60℃时分别检测FAM和HEX通道的荧光信号，选择反应体系40uL。10.上机后，结果有扩增曲线，结果判定为阴性。正常扩增曲线为标准S形扩增曲线。结果判断：1.阴性结果判定：FAM通道无Ct值显示，而HEX通道信号正常（Ct≤35.00），则该样品为阴性，如图1（BZL0001无CT值阴性）；2.阳性结果判定：2.1若样品的FAM通道Ct≤38.00,则判定样品为阳性，如图2(BZL00022扩增曲线为标准S形曲线，CT值=29阳性)；2.2若样品的38.00＜Ct≤45.00，则建议对样本进行复测。如复测结果仍为38.00＜Ct≤45.00或Ct≤38.00，则判定为阳性；如Ct不显示且HEX通道信号正常（Ct≤35.00），则判定为阴性。如图3(BZL0020CT=40灰区，需复测)、图4(FBZL0020复测后无CT值，扩增曲线正常，结果为阴性)。B族链球菌核酸检测的待测样品制备流程如下（现有技术）：1.在无菌涤纶拭子管中加入1mL生理盐水，用漩涡振荡器震荡混匀制成标本悬浮液。2.取出全部样品放入1.5mL离心管中，13000rpm离心10min弃上清。3.沉淀加无菌生理盐水1mL混匀，13000rpm离心5min弃上清。4.沉淀加入50uLDNA提取液充分震荡混匀，100℃加热处理10min。5.13000rpm离心10min，吸取上清至1.5mL离心管中保存，DNA提前完毕。6.向准备好的PCR反应管中分布加入5uL待测样品、阳性对照品和空白对照品，盖紧管盖后瞬时离心。7.通过样品传递窗转移至扩增区。8.将待测PCR反应管小心置于ABI7500实时荧光定量PCR仪中，进行扩增反应，根据扩增曲线进行结果判读，并发单（如图5所示）。如图5所示，采用现有技术方法操作处理，扩增曲线未起峰，无扩增结果，报告结果只能作退单处理，降低检出率。而本专利申请的技术方案处理同样的样本能够产生扩增曲线，提高样本GBSDNA的检出率。申请人声明，以上所述仅为本专利技术的具体实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种GBS DNA核酸检测方法，其特征在于：包括以下步骤：/na.在无菌涤纶拭子管中加入生理盐水，混匀制成标本悬浮液；/nb.取出全部样品，13000rpm离心10min弃上清；/nc.步骤b中获得的沉淀加无水乙醇，混匀，10000-13000rpm离心5-10min弃上清；/nd.步骤c中获得的沉淀加无菌生理盐水，混匀，13000rpm离心5-10min弃上清；/ne.步骤d中获得的沉淀加入DNA提取液，混匀，加热处理；/nf.13000rpm离心10min，吸取上清保存；/ng.向PCR反应管中加入步骤f中获得的待测样品后瞬时离心；/nh.将PCR反应管置于实时荧光定量PCR仪中，进行扩增反应，根据扩增曲线进行结果判读。/n

【技术特征摘要】
1.一种GBSDNA核酸检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.在无菌涤纶拭子管中加入生理盐水，混匀制成标本悬浮液；
b.取出全部样品，13000rpm离心10min弃上清；
c.步骤b中获得的沉淀加无水乙醇，混匀，10000-13000rpm离心5-10min弃上清；
d.步骤c中获得的沉淀加无菌生理盐水，混匀，13000rpm离心5-10min弃上清；
e.步骤d中获得的沉淀加入DNA提取液，混匀，加热处理；
f.13000rpm离心10min，吸取上清保存；
g.向PCR反应管中加入步骤f中获得的待测样品后瞬时离心；
h.将PCR反应管置于实时荧光定量PCR仪中，进行扩增反应，根据扩增曲线进行结果判读。


2.根据权利要求1所述的一种GBSDNA核酸检测方法，其特征在于：步骤c中，离心条件为13000rpm离心5min。


3.根据权利要求1所述的一种GBSDNA核酸检测方法，其特征在于：步骤e...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯利花，陈建春，周剑峰，李行，贾晓冬，郑宏刚，王超，
申请(专利权)人：天津金域医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12