商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL及其分子标记与应用制造技术

本发明专利技术公开了商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL及其分子标记与应用，所述的差异INDEL，分别位于地熊蜂参考基因组序列NC_015772.1的第14757029位核苷酸位点、NW_003566591.1的第623097位核苷酸位点以及NC_015772.1的第16893418核苷酸位点；本发明专利技术要解决的技术问题是结合三个INDEL遗传变异的分子标记更好的帮助地熊蜂育种家进行分子标记辅助育种，同时区分待测地熊蜂为进口商业化地熊蜂还是野生的地熊蜂。

【技术实现步骤摘要】
商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL及其分子标记与应用
本专利技术属于变异或遗传工程
，涉及商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL及其分子标记与应用。
技术介绍
蜜蜂是维持生态环境不可或缺的物种，对促进农业生产和维持生态系统平衡都非常重要。蜜蜂种类繁多，而区分不同种类的蜜蜂、甚至于区分同种类不同来源的蜜蜂对于养殖者来说有着非要重要的意义。目前蜂种鉴定主要依赖于形态学鉴定，误差较大，尤其是同一蜂种比如地熊蜂的鉴定更加难以从形态上快速鉴别，甚至使用基于线粒体COI基因的条形码技术也区分不开。熊蜂是重要的传粉昆虫，但近年来许多种类的熊蜂都发生了明显的数量下降现象。熊蜂数量下降的原因之一是外来熊蜂对引入地所造成的生物入侵。现在商业化最成功的熊蜂是来自于欧洲某公司的地熊蜂。该公司通过对野外捕获的野生地熊蜂进行人工驯化、选择及繁育，形成了现在商业化的地熊蜂。商业化的地熊蜂比野生的地熊蜂具有许多优良的繁殖及授粉性能，但是也会对引入地造成生态入侵。这种地熊蜂不仅与引入地的熊蜂种类抢夺食物、巢穴和配偶，而且还会引入外来的病原体，对引入地的生态系统造成破坏。而对于现有从国外引进的商业化地熊蜂和野生地熊蜂的快速区分，对于评估进口的商业化地熊蜂对生物入侵现状，以及对于保护生态安全非常重要。申请人在2019.04.25申请号为201910338173.7，名称为一个能够识别出商业化地熊蜂的分子标及其应用的专利申请，但其缺陷为仅含有一个单一的分子标记，无法对最终结果进行验证。且受检测的样本量低；本专利技术提供三个分子标记，从而能够互相验证最终结果，并且三个分子标记是从54只野生地熊蜂和24只商业化地熊蜂样本中检测出来。并且本专利技术从INDEL变异的层面进行对商业化地熊蜂和野生地熊蜂进行区分，是对之前SNP变异分子标记的补充。
技术实现思路
本专利技术就是针对上述存在的缺陷而提供商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL及其分子标记与应用。本专利技术要解决的技术问题是结合三个INDEL遗传变异的分子标记更好的帮助地熊蜂育种家进行分子标记辅助育种，同时区分待测地熊蜂为进口商业化地熊蜂还是野生的地熊蜂。本专利技术的商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL及其分子标记与应用技术方案为，商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL，所述的差异INDEL，分别位于地熊蜂参考基因组序列NC_015772.1的第14757029位核苷酸位点、NW_003566591.1的第623097位核苷酸位点以及NC_015772.1的第16893418核苷酸位点。所述的商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL，包括：（1）一号位点，即地熊蜂参考基因组序列NC_015772.1的第14757029位核苷酸位点，该INDEL位点以及侧翼序列为5’-AAGTGGTTATTTTATAAATGGAACTTGAAC[-/A]AAAAAATGCGTATAATTACAATTGGAGCGC-3’（序列表的序列1或序列2），其中该序列第31位核苷酸是此特异INDEL位点；基因型为野生型Del/Del或杂合型Del/A或商业型A/A；（2）二号位点，即地熊蜂参考基因组序列NW_003566591.1的第623097位核苷酸位点，该INDEL位点以及侧翼序列为5’-GTATTTAAAATGAATAATCTTCGGATCATA[-/G]GGCTGCGAGATTATTATTAAGAGGATTATT-3’（序列表的序列3或序列4），其中该序列第31位核苷酸是此特异INDEL位点；基因型为野生型Del/Del或杂合型Del/G或商业型G/G；（3）三号位点，即地熊蜂参考基因组序列NC_015772.1的第16893418位核苷酸位点，该INDEL位点以及侧翼序列为5’-ATAAAGAAAGTTTT[-/T]GTGAAATATAACACTGTACTATTACCGTCTTCACCTGTAAGGAAA-3’（序列表的序列5或序列6），其中该序列第16位核苷酸是此特异INDEL位点；基因型为野生型Del/Del或杂合型Del/Ins或商业型Ins/Ins。所述的商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL在区分或辅助区分待测地熊蜂为商业化地熊蜂还是野生的地熊蜂或制备区分或辅助区分待测地熊蜂为商业化地熊蜂还是野生的地熊蜂产品中的应用。所述的商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL在鉴定待测地熊蜂是否驯化过或制备鉴定待测地熊蜂是否驯化过产品中的应用。所述的商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL在选育易于室内饲养或授粉能力强的地熊蜂或制备选育易于室内饲养或授粉能力强的地熊蜂产品中的应用。所述的商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL在评价商业化地熊蜂是否已经对本土造成了生物入侵或制备评价商业化地熊蜂是否已经对本土造成了生物入侵产品中的应用。检测待测地熊蜂的三个特异INDEL位点基因型都为野生型还是商业型；若三个特异INDEL位点的基因型都为商业型，则该地熊蜂为或候选为商业化地熊蜂；若特异INDEL位点的基因型都为野生型，则该地熊蜂为或候选为野生地熊蜂。一种用于区分商业地熊蜂与野生地熊蜂的分子标记，包括以下引物组：用于检测共显性标记NC14757029的引物组如下：NC14757029FAMF1（序列表的序列7）：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTCCAATTGTAATTATACGCATTTTTTG-3’（该序列5’端21bp为FAM荧光探针对应的接头序列（下划线部分），该接头序列能够与LGCGenomics公司的KASP试剂中的FAM荧光探针相匹配，在扩增情况下，产生FAM荧光（蓝色）；3’端27bp为INDEL位点A等位基因特异的缺失，该序列与相应的参考基因组序列为反向互补关系）；NC14757029HEXF1（序列表的序列8）：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCAATTGTAATTATACGCATTTTTTTG-3’（该序列5’端21bp为HEX荧光探针对应的接头序列，该接头序列能够与LGCGenomics公司的KASP试剂中的HEX荧光探针相匹配，在扩增情况下，产生HEX荧光（红色）；3’端27bp为INDEL位点A等位基因特异的插入，该序列与相应的参考基因组序列为反向互补关系）；NC14757029R（序列表的序列9）：5’-CGATAAATGCGTGCAAAGTGGTT-3’；用于检测共显性标记NW623097的引物组如下：NW623097FAMF1（序列表的序列10）：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCCTCTTAATAATAATCTCGCAGCCT-3’（该序列5’端21bp为FAM荧光探针对应的接头序列（下划线部分），该接头序列能够与LGCGenomics公司的KASP试剂中的FAM荧光探针相匹配，在扩增情况下，产生FAM荧光（蓝色）；3’端26bp为INDEL位点G等位基因特异的缺失，该序列与相应的参考本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL，其特征在于，所述的差异INDEL，分别位于地熊蜂参考基因组序列NC_015772.1的第14757029位核苷酸位点、NW_003566591.1的第623097位核苷酸位点以及NC_015772.1的第16893418核苷酸位点。/n

【技术特征摘要】
1.商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL，其特征在于，所述的差异INDEL，分别位于地熊蜂参考基因组序列NC_015772.1的第14757029位核苷酸位点、NW_003566591.1的第623097位核苷酸位点以及NC_015772.1的第16893418核苷酸位点。


2.根据权利要求1所述的商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL，其特征在于，（1）一号位点，即地熊蜂参考基因组序列NC_015772.1的第14757029位核苷酸位点，该INDEL位点以及侧翼序列为5’-AAGTGGTTATTTTATAAATGGAACTTGAAC[-/A]AAAAAATGCGTATAATTACAATTGGAGCGC-3’，其中该序列第31位核苷酸是此特异INDEL位点；基因型为野生型Del/Del或杂合型Del/A或商业型A/A；
（2）二号位点，即地熊蜂参考基因组序列NW_003566591.1的第623097位核苷酸位点，该INDEL位点以及侧翼序列为5’-GTATTTAAAATGAATAATCTTCGGATCATA[-/G]GGCTGCGAGATTATTATTAAGAGGATTATT-3’，其中该序列第31位核苷酸是此特异INDEL位点；基因型为野生型Del/Del或杂合型Del/G或商业型G/G；
（3）三号位点，即地熊蜂参考基因组序列NC_015772.1的第16893418位核苷酸位点，该INDEL位点以及侧翼序列为5’-ATAAAGAAAGTTTT[-/T]GTGAAATATAACACTGTACTATTACCGTCTTCACCTGTAAGGAAA-3’，其中该序列第16位核苷酸是此特异INDEL位点；基因型为野生型Del/Del或杂合型Del/Ins或商业型Ins/Ins。


3.如权利要求1所述的商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL在区分或辅助区分待测地熊蜂为商业化地熊蜂还是野生的地熊蜂或制备区分或辅助区分待测地熊蜂为商业化地熊蜂还是野生的地熊蜂产品中的应用。


4.如权利要求1所述的商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL在鉴定待测地熊蜂是否驯化过或制备鉴定待测地熊蜂是否驯化过产品中的应用。


5.如权利要求1所述的商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL在选育易于室内饲养或授粉能力强的地熊蜂或制备选育易于室内饲养或授粉能力强的地熊蜂产品中的应用。


6.如权利要求1所述的商业地熊蜂与野生地熊蜂的差异INDEL在评价商业化地熊蜂是否已经对本土造成了生物入侵或制备评价商业化地熊蜂是否已经对本土造成了生物入侵产品中的应用。


7.如权利要求3-6任一权利要求所述的应用，其特征在于，检测待测地熊蜂的三个特异INDEL位点基因型都为野生型还是商业型；若三个特异INDEL位点的基因型都为商业型，则该地熊蜂为或候选为商业化地熊蜂；若特异INDEL位点的基因型都为野生型，则该地熊蜂为或候选为野生地熊蜂。


8.一种用于区分商业地熊蜂与野生地熊蜂的分子标记，其特征在于，包括以下引物组：
用于检测共显性标记NC14757029的引物组如下：
NC14757029FAMF1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTCCAATTGTAATTATACGCATTTTTTG-3’；
NC14757029HEXF1：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCAATTGTAATTATACGCATTTTTTTG-3’；
NC14757029R：5’-CGATAAATGCGTGCAAAGTGGTT-3’；
用于检测共显性标记NW623097的引物组如下：
NW623097FAMF1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCCTCTTAATAATAATCTCGCAGCCT-3’；
NW623097HEXF1：
...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙成，苏龙，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11