一种区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的分子标记、试剂盒及区分方法技术

一种区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的分子标记、试剂盒及区分方法，它涉及一种区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的分子标记、试剂盒及其应用。本发明专利技术区分引物对为HLJFLf2和HLJFLr2。本发明专利技术区分试剂盒括分子标记引物对HLJFLf2和HLJFLr2。本发明专利技术区分方法：一、提取待测基因组DNA；二、以提取的基因组DNA为模板，以HLJFLf2和HLJFLr2为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；三、对PCR产物进行电泳检测，电泳结果仅出现249bp条带的对应个体为纯种黑龙江三角鲂，仅出现335bp条带的个体为纯种团头鲂，同时出现249bp和335bp条带的为黑龙江三角鲂与团头鲂的杂交种。

A molecular marker, kit and method for distinguishing Megalobrama amblycephala, Megalobrama amblycephala and their hybrids

【技术实现步骤摘要】
一种区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的分子标记、试剂盒及区分方法
本专利技术涉及一种区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的分子标记、试剂盒及其应用。
技术介绍
我国现存鲂属鱼类有4个种，分别为长江上游的厚颌鲂、长江中下游大型湖泊中的团头鲂(武昌鱼)、珠江和海南诸水系的广东鲂和广泛分布多个水系的三角鲂。黑龙江三角鲂是黑龙江流域特有的名鱼“三花五罗”中的“法罗”，也是黄河以北唯一自然分布的鲂属鱼类。该鱼个体大、抗逆性强、脂高味美，养殖潜力巨大；另一方面，长期地理隔离和独特生境可能使其蕴藏未来鲂属鱼类育种所需的关键基因或标记，体现了其潜在的科研价值。长期捕捞和污染已使栖息在松花江、嫩江、镜泊湖和兴凯湖的三角鲂种群绝迹多年，现每年仅在中俄界江黑龙江抚远江段可见少量三角鲂个体。黑龙江三角鲂已被俄罗斯列入濒危鱼类保护红皮书，但尚未引起我国相关部门的重视。由于其性成熟晚(5龄以上)、易捕捞、群体恢复缓慢，该鱼正面临灭绝危机。鲂属不同种类形态均极为相似，特别在性成熟前的早期生长阶段。从现有的形态学研究看，还缺乏直观、明显的差异可区分黑龙江三角鲂与其他鲂属鱼类的方法。为此申请人已于2018年提出“一种区分黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类的分子标记、试剂盒及区分方法”申请，该技术方案利用分子标记技术在未发生杂交的情况下，可用于区别黑龙江三角鲂与南方鲂属鱼类(钱塘江三角鲂、金沙河水库三角鲂、团头鲂和厚颌鲂)。近几年，养殖团头鲂(俗称武昌鱼)的产量逐年增加，其培育品种“浦江1号”开始越来越多地出现在东北养殖水域，给黑龙江三角鲂的基因库带来了潜在威胁。目前，现有技术无法对黑龙江三角鲂和团头鲂及其杂交种进行准确鉴别，因此是否在黑龙江流域的相关江段存在二者的天然杂交种仍不清楚，急需一种检测黑龙江三角鲂和团头鲂及其杂交种的技术方法，以更好地保护濒危的黑龙江三角鲂种质资源。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可区分黑龙江三角鲂和广泛养殖的团头鲂及其杂交种的方法及分子标记。本专利技术区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的分子标记的引物对为HLJFLf2和HLJFLr2，具体序列为：HLJFLf2：5'-GCAACCGTTTGTCTGCTATG-3'HLJFLr2：5'-CCACAGCCTTAGATGGAATC-3'。本专利技术区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的试剂盒，该试剂盒包括分子标记引物对HLJFLf2和HLJFLr2。本专利技术区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的方法按以下步骤进行：一、提取待测鱼类鳍条的基因组DNA；二、以提取的基因组DNA为模板，以HLJFLf2和HLJFLr2为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；三、对PCR产物进行电泳检测，电泳结果仅出现249bp条带的对应个体为纯种黑龙江三角鲂，仅出现335bp条带的个体为纯种团头鲂，同时出现249bp和335bp条带的为黑龙江三角鲂与团头鲂的杂交种；其中，HLJFLf2：5'-GCAACCGTTTGTCTGCTATG-3'HLJFLr2：5'-CCACAGCCTTAGATGGAATC-3'。进一步，该方法还包括步骤四，步骤四：以杂交种个体基因组DNA为模板，用分子标记引物对HLJFLf1与HLJFLr1进行PCR扩增，获得PCR产物；利用限制性内切酶TaqI对PCR产物进行酶切；凝胶电泳中出现180bp和200bp双条带的对应个体是父本为团头鲂、母本为黑龙江三角鲂的杂交种；凝胶电泳中出现157bp和223bp双条带的个体是母本为团头鲂、父本为黑龙江三角鲂的杂交种；其中，HLJFLf1：5'-GCATCTGGCTTCAATCTCA-3'；HLJFLr1：5'-GATTTGCTGAGCGTAGGG-3'。本专利技术分子标记引物对可以快速、高效、稳定的区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种。采用本专利技术提供的鉴定试剂盒和方法，可直接对黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种进行区分、鉴定，且可对杂交种的父母本来源进行进一步区分，该方法的准确性高、操作过程简洁、用时短，准确率达到100％。采用本专利技术可准确地鉴别黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种，而且能确定其亲本来源，可应用于适时掌握濒危的黑龙江三角鲂基因库是否受到养殖团头鲂的污染，这对于黑龙江三角鲂种质资源的科学保护具有重要意义。附图说明图1是实施例1样品经分子标记的引物对为HLJFLf2和HLJFLr2扩增后的凝胶电泳图。图2是实施例2编号7-12的样品经分子标记的引物对为HLJFLf1和HLJFLr1扩增后的凝胶电泳图。图3是实施例2编号7-12的样品PCR产物分别进行酶切后的凝胶电泳图。具体实施方式具体实施方式一：本专利技术区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的分子标记的引物对为HLJFLf2和HLJFLr2，具体序列为：HLJFLf2：5'-GCAACCGTTTGTCTGCTATG-3'HLJFLr2：5'-CCACAGCCTTAGATGGAATC-3'。具体实施方式二：区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括分子标记引物对HLJFLf2和HLJFLr2。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点在于该试剂盒还包括去离子水、10×TaqBuffer、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶、RE缓冲液10×Buffer、牛血清白蛋白BSA、TaqI内切酶和分子标记引物对HLJFLf1与HLJFLr1；其中，HLJFLf1：5'-GCATCTGGCTTCAATCTCA-3'；HLJFLr1：5'-GATTTGCTGAGCGTAGGG-3'。其它与具体实施方式二相同。具体实施方式四：本实施方式区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：一、提取待测鱼类鳍条的基因组DNA；二、以提取的基因组DNA为模板，以HLJFLf2和HLJFLr2为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；三、对PCR产物进行电泳检测，电泳结果仅出现249bp条带的对应个体为纯种黑龙江三角鲂，仅出现335bp条带的个体为纯种团头鲂，同时出现249bp和335bp条带的为黑龙江三角鲂与团头鲂的杂交种；其中，HLJFLf2：5'-GCAACCGTTTGTCTGCTATG-3'HLJFLr2：5'-CCACAGCCTTAGATGGAATC-3'。具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四的不同点在于步骤二中PCR扩增体系如下：其它与具体实施方式四相同。具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四或五的不同点在于步骤二中PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共30个循环，再72℃延伸5min，4℃保温。其它与具体实施方式四或五相同。具体实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的分子标记，其特征在于该分子标记的引物对为HLJFLf2和HLJFLr2，具体序列为：/nHLJFLf2：5'-GCAACCGTTTGTCTGCTATG-3'/nHLJFLr2：5'-CCACAGCCTTAGATGGAATC-3'。/n

【技术特征摘要】
1.一种区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的分子标记，其特征在于该分子标记的引物对为HLJFLf2和HLJFLr2，具体序列为：
HLJFLf2：5'-GCAACCGTTTGTCTGCTATG-3'
HLJFLr2：5'-CCACAGCCTTAGATGGAATC-3'。


2.一种区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括分子标记引物对HLJFLf2和HLJFLr2。


3.根据权利要求2所述的一种区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括去离子水、10×TaqBuffer、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶、RE缓冲液10×Buffer、牛血清白蛋白BSA、TaqI内切酶和分子标记引物对HLJFLf1与HLJFLr1；其中，HLJFLf1：5'-GCATCTGGCTTCAATCTCA-3'
HLJFLr1：5'-GATTTGCTGAGCGTAGGG-3'。


4.区分黑龙江三角鲂与团头鲂及其杂交种的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、提取待测鱼类鳍条的基因组DNA；
二、以提取的基因组DNA为模板，以HLJFLf2和HLJFLr2为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；
三、对PCR产物进行电泳检测，电泳结果仅出现249bp条带的对应个体为纯种黑龙江三角鲂，仅出现335bp条带的个体为纯种团头鲂，同时出现249bp和335bp条带的为黑龙江三角鲂与团头鲂的杂交种；
其中，HLJFLf2：5'-GCAACCGTTTGTCTGCTATG-3'
HLJFLr2：5'-CCACAGCCTTAGATGGAATC-3'。

【专利技术属性】
技术研发人员：胡雪松，石连玉，栾培贤，姜晓娜，贾智英，李池陶，葛彦龙，王世会，张秋军，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23