一种15种动物源性成分的PCR高分辨熔解检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种15种动物源性成分的PCR高分辨熔解检测试剂盒及检测方法，技术方案为：一种15种动物源性成分的PCR高分辨熔解检测试剂盒及检测方法，通过引物优化筛选，采用3对通用引物联合检测，利用物种的熔解温度Tm作为特征值建立标准库，可以快速、简便地检测肉及肉制品中黄牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、兔、马、驴、猪、狗、猫、鼠、狐、貂、貉15种动物源性成分。本发明专利技术简便快速，无需琼脂糖电泳避免了交叉污染，不需要针对每个物种设计相应的特异性引物；借鉴统计学上PCA、LDA的分析方法使得检测结果更加可视化；与传统的多种PCR技术相比，克服了引物之间的竞争问题，大大提高了检测效率，降低了反应成本。

【技术实现步骤摘要】
一种15种动物源性成分的PCR高分辨熔解检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于肉及肉制品安全检测领域，具体涉及一种15种动物源性成分的PCR高分辨熔解检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
随着社会经济的快速发展，受暴利驱使的食品掺假犯罪活动日益增多。近年来，由于欧洲“马肉事件”，沃尔玛“驴肉掺假”等食品欺诈问题层出不穷，引起了人们对肉制品安全的高度重视。目前我国市场上肉制品掺假按掺假形式主要分为三类，第一类是商家将一些低价肉（猪、鸡、鸭肉）掺杂到高价肉（牛羊肉）当中，经过一些加工处理手段让人难以从感官上分辨出来；第二类是用一些不可食用的肉物种（狐狸肉、貂肉等）进行掺假；第三类是用一些来源不明的物种（鼠肉、猫肉等）进行冒充，这类现象常常出现在流动摊贩，也是行为最恶劣的一种。因此随着掺假物种的种类增多，一种高通量鉴别检测方法对于维护消费者合法权益、保障食品安全以及促进肉类行业的健康发展至关重要。随着分子生物学的发展，目前针对肉制品中动物源性成分检测方法主要形成了以蛋白检测和DNA分析两个不同的检测方向。由于核酸的稳定性和种间多态性，目前以PCR为基础的检测方法成为肉物种成分鉴别的主流技术。虽然已经有研究建立了多种用于肉及肉制品的PCR检测方法，但通常能够同时检测的动物源性成分数量有限；并且大部分现行标准只是针对单一物种或者相近物种的检测，对于未知物种更是难以鉴别。为了克服这种局限，2018年发布的国家食品安全标准均采用PCR阵列芯片提高可检测物种的种类（GB/T35917-2018膜芯片，11种；GB/T35024-2018液相芯片，13种）。但是这些方法大都基于特异性引物，设计引物繁琐复杂；阵列芯片检测需要的流程复杂，并且开管操作容易造成交叉污染，限制了其推广应用。高分辨熔解曲线技术（highresolutionmeltinganalysis，HRM）是2003年由美国Wittwer实验室建立的一项闭管检测基因变异和基因分型的DNA分析技术。它的反应原理主要依赖于PCR完成之后，产物双链DNA在逐渐升高温度下的熔解行为，通过持续检测第三代嵌入性饱和染料的荧光强度值变化，从而获得相应的特异性熔解曲线图谱。经典的熔解曲线一般采用的是不饱和染料，通常监测的熔解温度差异>1℃，无法区分序列之间的较小的差异，而HRM分析利用专业化的仪器和数据分析软件以及第三代饱和染料，实现了序列之间细微差异的检测，其可以监测熔解温度差异<0.5℃。
技术实现思路
本专利技术的目的是要提供一种15种动物源性成分的PCR高分辨熔解检测试剂盒及检测方法，采用5对通用引物联合检测，利用物种的熔解温度（Tm）作为特征值建立标准库，可以快速、简便地检测肉及肉制品中黄牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊等15种动物源性成分。为实现以上目的，本专利技术采用以下技术方案：一种15种动物源性成分的PCR高分辨熔解检测试剂盒，包括5对通用性引物、PCR反应混合液、饱和荧光染料、双蒸水、动物源性成分的基因组DNA及哺乳动物鉴别标准图谱；所述的通用性引物具体序列为：97bp对应的引物序列为：上游引物：5'-CAGACATCTGGTTCTTTCTTCAGGGC-3'；下游引物：5'-GGGCTGATTAGTCATTAGTCCAT-3'；100bp对应的引物序列为：上游引物：5'-AGGATCCATTGGAGGGCAAGT-3'；下游引物：5'-TCCAACTACGAGCTTTTTAACTGCA-3'；140bp对应的引物序列为：上游引物：5'-TCCCAGTACGAAAGGACAAGA-3'；下游引物：5'-CAATTACCGGGCTCTGCCA-3'；180bp对应的引物序列为：上游引物：5'-AGCCTGAGAAACGGCTACC-3'；下游引物：5'-TGCTGGCACCAGACTTGCC-3'；230bp对应的引物序列为：上游引物：5'-ACAAGACGAGAAGACCC-3'；下游引物：5'-GATTGCGCTGTTATCCC-3'。所述动物源性成分的基因组DNA为黄牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、兔、马、驴、猪、狗、猫、鼠、狐、貂、貉。一种15种动物源性成分的PCR高分辨熔解的检测方法：1）参考黄牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、兔、马、驴、猪、狗、猫、鼠、狐、貂、貉15种哺乳动物的基因序列，设计筛选5对通用引物，所述的通用性引物具体序列为：97bp对应的引物序列为：上游引物：5'-CAGACATCTGGTTCTTTCTTCAGGGC-3'；下游引物：5'-GGGCTGATTAGTCATTAGTCCAT-3'；100bp对应的引物序列为：上游引物：5'-AGGATCCATTGGAGGGCAAGT-3'；下游引物：5'-TCCAACTACGAGCTTTTTAACTGCA-3'；140bp对应的引物序列为：上游引物：5'-TCCCAGTACGAAAGGACAAGA-3'；下游引物：5'-CAATTACCGGGCTCTGCCA-3'；180bp对应的引物序列为：上游引物：5'-AGCCTGAGAAACGGCTACC-3'；下游引物：5'-TGCTGGCACCAGACTTGCC-3'；230bp对应的引物序列为：上游引物：5'-ACAAGACGAGAAGACCC-3'；下游引物：5'-GATTGCGCTGTTATCCC-3'；2）以不同的哺乳动物基因组DNA为模板，利用步骤1）所设计的通用引物进行PCR扩增；3）将步骤2）扩增产物进行高分辨熔解分析，采集不同动物种类在不同的通用引物扩增下的熔解温度特征信息，经过统计学方法处理，建立15种哺乳动物鉴别标准图谱；4）以待检测样本中的DNA为模板，按照步骤2）和步骤3）的方法进行判别分析，将分析结果与标准图谱中相应物种的分布位置作对比，从而确定样品中的动物源性成分。所述的PCR扩增反应体系包括2×TaqPCRMasterMix、饱和荧光染料、引物、不同动物的DNA模板以及双蒸水。所述步骤2）中PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性15s，58℃退火20s，72℃延伸30s，再延伸5min。所述步骤3）中高分辨熔解分析条件为：扩增结束后，将扩增产物采用高分辨熔解在65℃-95℃之间进行分析，熔解速率为0.05℃/s，每个物种6个复孔测定。所述步骤3）中统计学方法处理的方法为：采用主成分分析和线性判别分析方法对数据进行统计处理，通过线性判别分析中的jack-knife验证分析，根据每对引物在物种鉴别中的准确率为评价指标来对引物进行筛选和优化。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术以物种的熔解温度为其特有的特征信息，利用3对通用引物可以同时对黄牛、水牛、牦牛、山羊本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种15种动物源性成分的PCR高分辨熔解检测试剂盒，其特征在于：/n包括5对通用性引物、PCR反应混合液、饱和荧光染料、双蒸水、动物源性成分的基因组DNA及哺乳动物鉴别标准图谱；/n所述的通用性引物具体序列为：/n97bp对应的引物序列为：/n上游引物：5'- CAGACATCTGGTTCTTTCTTCAGGGC -3'；/n下游引物：5'-GGGCTGATTAGTCATTAGTCCAT -3'；/n100bp对应的引物序列为：/n上游引物：5'-AGGATCCATTGGAGGGCAAGT-3'；/n下游引物：5'-TCCAACTACGAGCTTTTTAACTGCA-3'；/n140bp对应的引物序列为：/n上游引物：5'-TCCCAGTACGAAAGGACAAGA-3'；/n下游引物：5'-CAATTACCGGGCTCTGCCA-3'；/n180bp对应的引物序列为：/n上游引物：5'-AGCCTGAGAAACGGCTACC-3'；/n下游引物：5'-TGCTGGCACCAGACTTGCC-3'；/n230bp对应的引物序列为：/n上游引物：5'-ACAAGACGAGAAGACCC-3'；/n下游引物：5'-GATTGCGCTGTTATCCC-3'。/n...

【技术特征摘要】
1.一种15种动物源性成分的PCR高分辨熔解检测试剂盒，其特征在于：
包括5对通用性引物、PCR反应混合液、饱和荧光染料、双蒸水、动物源性成分的基因组DNA及哺乳动物鉴别标准图谱；
所述的通用性引物具体序列为：
97bp对应的引物序列为：
上游引物：5'-CAGACATCTGGTTCTTTCTTCAGGGC-3'；
下游引物：5'-GGGCTGATTAGTCATTAGTCCAT-3'；
100bp对应的引物序列为：
上游引物：5'-AGGATCCATTGGAGGGCAAGT-3'；
下游引物：5'-TCCAACTACGAGCTTTTTAACTGCA-3'；
140bp对应的引物序列为：
上游引物：5'-TCCCAGTACGAAAGGACAAGA-3'；
下游引物：5'-CAATTACCGGGCTCTGCCA-3'；
180bp对应的引物序列为：
上游引物：5'-AGCCTGAGAAACGGCTACC-3'；
下游引物：5'-TGCTGGCACCAGACTTGCC-3'；
230bp对应的引物序列为：
上游引物：5'-ACAAGACGAGAAGACCC-3'；
下游引物：5'-GATTGCGCTGTTATCCC-3'。


2.根据权利要求1所述的一种15种动物源性成分的PCR高分辨熔解检测试剂盒，其特征在于：所述动物源性成分的基因组DNA为黄牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、兔、马、驴、猪、狗、猫、鼠、狐、貂、貉。


3.一种15种动物源性成分的PCR高分辨熔解的检测方法，其特征在于：
具体包括以下步骤：
1）参考黄牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、兔、马、驴、猪、狗、猫、鼠、狐、貂、貉15种哺乳动物的基因序列，设计筛选5对通用引物，所述的通用性引物具体序列为：
97bp对应的引物序列为：
上游引物：5'-CAGACATCTGGTTCTTTCTTCAGGGC-3'；
下游引物：5'-GGGCTGATTAGTCATTAGTCCAT-3'；
100bp对应的引物序列为：
上游引物：5'-AGGATCCATTGGAGGGCAAGT-3'；
下游引物：5'-TCCAACTACGAGCTTTTTAACTGCA-3'；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐秦峰，闵红卫，曹云刚，李敏康，蔡露阳，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61